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1、金納米棒在碘-125粒子肝癌治療中放射增敏作用的基礎研究目錄一、研究背景二、研究內(nèi)容 三、研究結果四、成果展示五、展望本研究受如下資金資助國家自然科學基金自助項目: 金納米棒聯(lián)合碘-125粒子植入治療肝癌的實驗研究（81071240）研究背景1.肝癌是常見的惡性腫瘤之一，全球發(fā)病率居第5位，死亡率居第3位。2.我國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，全國腫瘤登記中心最新公布的2012年腫瘤登記年報數(shù)據(jù)顯示，我國肝癌發(fā)病率為28.71/105，占所有惡性腫瘤的第4位(10.04)，而死亡率為26.04/105，占所有癌癥死亡的第2位，僅次于肺癌。 1Pakin DM,Bray F,Ferlay J,et

2、 al.Estimating the world cancer burden:Globocan 2002J.CA Cancer J Clin,2005,55(2):74-75.2葉勝龍.2013年肝癌領域新進展.中華肝臟病雜志,2014,22:1-4.3.肝癌手術切除者僅為10左右，肝移植受到肝源的限制，因此，綜合各種手段治療肝癌已達成共識。4.肝癌屬于放射敏感性腫瘤,國內(nèi)外已有多篇臨床研究報道125I粒子組織間植入治療肝癌取得較好療效，其對于肝臟腫瘤的治療非常重要，因此研究新的放療方案，改善放療方法對晚期腫瘤病人的治療意義極大。男，男，64歲，肝癌術后歲，肝癌術后1年復發(fā)。年復發(fā)。 高分化腺

3、癌高分化腺癌術術 前前術后一月術后一月怎么克服125I粒子的缺點？增強對腫瘤細胞的放射毒性，同時減少對正常細胞損傷，即研發(fā)應用腫瘤靶向放療增敏劑，是提高125I粒子療效的策略之一。最近有文獻報道金納米顆粒對體外腫瘤細胞有放射增敏作用，金納米棒的增敏作用目前被廣泛關注。 4Gui C,Cui DX.Functionalized Gold Nanorods for Tumor Imaging and Targeted Therapy.Cancer Biol Med. 2012;9:221-233.5Liu CJ,Wang CH,Chen SH,et al.Enhancement of cell r

4、adiation sensitivity by pegylated gold nanoparticles.Phys Med Biol. 2010;55:931-945.放射的冷點及熱點 難以達到完全適形治療 腫瘤體積縮小，粒子邊緣化，對周圍正常組織的放射損傷5.但由于粒子植入過程中是人工操作，存在以下問題：3Brent Herron, Alex Herron, Kathryn Howell,Daniel Chin and Luann Roads,A Review of Radiation Therapys Role in Early-Stage Breast Cancer and an Int

5、roduction to Electronic BrachytherapyJ.Cancer Treatment-Conventional and Innovative Approaches.2013(5)223-238.金納米棒對腫瘤放療增敏的機制金納米棒對腫瘤放療增敏的機制第一，輻射敏感材料的光電吸收橫截面直接取決于原子半徑大小。金原子(原子序數(shù)Z=79)比其他對輻射敏感的材料更敏感，如碳(Z=6)、碘(Z=53)、釓(Z=64)和鉑(Z=78)，通過光電效應可以產(chǎn)生更強的輻射增強效果。第二，金納米棒的尺寸遠大于金原子，其光電吸收截面積遠超越金原子，所以在腫瘤組織內(nèi)產(chǎn)生的光電吸收劑量將顯著增

6、加。8Cho SH,Jones BL,Krishnan S.The dosimetric feasibility of gold nanoparticle-aided radiation therapy(GNRT) viabrachytherapy using low-energy gamma-/x-ray sources.Phys Med Biol.2009;54:4889-4905.第三，金納米棒的表面等離子共振特性，即當光入射時在特定波長范圍內(nèi)具有強的光吸收能力和光熱光熱治療治療 ，增強的光吸收量也可有效增強腫瘤組織的吸收劑量。另外，金納米棒具有強光散射能力，也能間接增強腫瘤組織的輻射劑

7、量。9Park YS,Kasuya A,Dmytruk A,et al.Concentrated colloids of silica-encapsulated gold nanoparticles:colloidal stability,cytotoxicity,and X-ray absorption. Nanosci Nanotechnol.2007;7(8):2690-2695.如何能夠?qū)⒔鸺{米棒引入腫瘤細胞內(nèi)，以期發(fā)揮更好的腫瘤靶向治療效果是本課題的關鍵所在！ 在納米粒子表面偶聯(lián)特異性的靶向分子，通過靶向分子與細胞表面特異性受體結合，實現(xiàn)主動靶向治療，增強放療的同時，降低毒副作用，有

8、望在腫瘤的靶向性放療領域?qū)崿F(xiàn)突破。 用于靶向腫瘤的常見配體中，葉酸是葉酸受體的天然配體，葉酸受體在健康細胞的表達有限，但在上皮腫瘤細胞中過度表達。而肝癌屬于腺上皮來源，肝癌細胞表面具有豐富的FA 受體。本研究制備了一種新型的金納米材料葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒。6Franzen S A comparison of peptide and folate receptor targeting of cancer cells: from single agent to nanoparticleJExpert Opin Drug Deliv，2011，8：281.7DAngelica M, Amm

9、ori J, Gonen M,et al. Folate receptor-alpha expression in resectable hepatic colorectal cancer metastases: patterns and significance. Mod Pathol, 2011, 24:1221-1228.研究意義研究意義1 研發(fā)一種新型的復合納米顆粒，通過體外及體內(nèi)實驗研究探討其腫瘤靶向能力的強弱。2 探討納米金對125I的放射增敏作用，為納米金主動靶向技術用作放射治療增敏劑奠定前期研究基礎。3 探討葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒（GNRsSiO2-FA）聯(lián)合125I粒

10、子誘導肝癌HepG2細胞凋亡及其可能的機制，為臨床提高肝癌125I粒子組織間植入療效提供理論依據(jù)。研究內(nèi)容研究內(nèi)容第一部分 制備GNRsSiO2-FA及其表征第二部分 體外細胞實驗（1）建立碘-125粒子模型（2）GNRsSiO2-FA聯(lián)合125I粒子對肝癌HepG2細胞凋亡的影響第三部分 體內(nèi)動物實驗（1）建立VX-2兔肝癌模型（2）VX-2兔肝癌模型對GNRsSiO2-FA攝取狀況的研究（3）GNRsSiO2-FA聯(lián)合125I粒子內(nèi)放療對兔VX2肝癌凋亡及其相關蛋白表達的影響技術路線技術路線放射增敏實驗毒性及靶向?qū)嶒炁悸?lián)葉酸表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒制備金納米棒制備金納米棒偶聯(lián)葉酸

11、表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒毒性及靶向?qū)嶒炁悸?lián)葉酸表面氨基化二氧化硅包覆制備金納米棒第一部分 制備葉酸偶聯(lián)二氧化硅包覆的金納米棒及對其表征金納米棒制備金納米棒制備金種子（直徑5nm)在模板誘導下一維生長成棒狀結構?？刂萍尤虢鸱N子和銀離子的量就可以控制棒的長度。二氧化硅包覆金納米棒二氧化硅包覆金納米棒溶膠凝膠法溶膠凝膠法硅源試劑硅源試劑（TEOS）二氧化硅包覆的金納米是一種核-殼結構。葉酸偶聯(lián)金納米棒的制備葉酸偶聯(lián)金納米棒的制備葉酸葉酸共價鍵共價鍵葉酸的生物功能主要是由分子中的2-氨基-4-羥基-6-甲基蝶呤功能基團提供的，我們利用羧基與氨基反應生成共價鍵，不會影響葉酸的生物功能。表征表征

12、通過透射電鏡、掃描電鏡、電子衍射、紫外紅外吸收光譜等對葉酸偶聯(lián)金納米棒進行表征。金納米棒表征金納米棒表征紫外吸收光譜紫外吸收光譜圖1a金納米棒UV吸收圖譜（516 nm和712 nm ） 圖1b 不同長度金納米棒UV吸收圖譜紫外吸收圖譜：金納米棒有兩個特征吸收峰，橫向SPR及縱向SPR，縱向SPR是光熱治療的物理基礎。（SPR，表面等離子體共振）紫外吸收圖譜：橢球形二氧化硅殼層包覆前后金納米棒兩個特征吸收峰位置基本沒有發(fā)生變化。GNRSiO2-FA出現(xiàn)了葉酸苯環(huán)的特征峰，證實葉酸偶聯(lián)成功。圖1c 橢球形GNRSiO2 UV圖譜 圖1d FA和GNRSiO2-FA UV圖譜二氧化硅包覆的金納米棒

13、二氧化硅包覆的金納米棒UV二氧化硅包覆的金納米棒二氧化硅包覆的金納米棒掃描電鏡、掃描電鏡、電子衍射電子衍射圖2 橢球形GNRSiO2 TEM圖 圖3 GNRSiO2 電子衍射圖 電子衍射圖：陣代表單晶的金納米棒，圓環(huán)代表非晶的二氧化硅，證實了核-殼結構。金納米棒的表征電鏡下觀察 圖3 金納米棒TEM圖（15000X） 圖4 金納米棒TEM圖（600KX）TEM：金納米棒大小均一，分散性較好金納米棒大小均一，分散性較好(這是評價納米材料性質(zhì)的主要指標之一），這是評價納米材料性質(zhì)的主要指標之一），高倍電鏡可以清除地觀察金納米棒的晶格結構。高倍電鏡可以清除地觀察金納米棒的晶格結構。金納米棒的表征電鏡

14、下觀察圖5 金納米棒SEM圖（600KX）二氧化硅包覆的金納米棒表征二氧化硅包覆的金納米棒表征透射電鏡觀察透射電鏡觀察 圖4 橢球形GNRSiO2 TEM圖(包覆層較厚） 靶向納米探針靶向納米探針體外生物安全性體外生物安全性和靶向性實驗和靶向性實驗體外培養(yǎng)肝癌HepG2細胞MTT法檢測生物相容性ICP-MS檢測靶向性體外細胞毒性實驗體外細胞毒性實驗加藥A組，加藥B組分別加入GNRsSiO2-FA、GNRs，金元素含量分別為2.5 、5、10、20、40ppm。細胞存活率=1（對照組加藥組）/對照組100%。 MTT法檢測OD值96孔板培養(yǎng)肝HepG2細胞加藥A組調(diào)零組對照組加藥B組GNRsSi

15、O2-FA細胞攝入的靶向性檢測結細胞攝入的靶向性檢測結果果組別組別 培養(yǎng)時間（培養(yǎng)時間（h h）24 816 24 GNRsSiOGNRsSiO2 2 組組256.73.3 602.82.41067.13.61998.54.3 2078.51.3 GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA組組693.12.0 1432.02.6 2331.33.5 2484.55.0 2589.72.1 F F 值值 P P 值值3278.070p0.0134287.199p0.0185434.870p0.0118333.454p0.0142412.973p0.01培養(yǎng)2 h時，GNRsSiO2-FA組的

16、細胞攝取率遠高于GNRsSiO2組，是其攝入量的2.7倍，隨著時間的延長，兩組之間的差距逐漸減小；超過16h，兩組細胞攝入量均開始進入平臺期，細胞攝入率變化較?。ū?），兩組差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 電鏡觀察細胞攝取納米顆粒電鏡觀察細胞攝取納米顆粒1 h后，可觀察到已有GNRsSiO2-FA與細胞膜接觸，細胞伸出偽足（圖5）；共同孵育4 h后，有更多的納米顆粒與細胞膜接觸，并有膜樣結構的吞噬泡形成，細胞質(zhì)中有少量的金納米顆粒(圖6)；GNRsSiO2-FA 與HepG2細胞培養(yǎng)電鏡下觀察結果，培養(yǎng)1 h（圖5），培養(yǎng) 4 h（圖6）GNRsSiO2-FA 與HepG2細胞培養(yǎng)電鏡下觀察

17、結果，培養(yǎng)12 h（圖7），培養(yǎng) 24 h（圖8）12 h后見細胞質(zhì)內(nèi)大量金納米顆粒，部分靠近細胞核的邊緣，細胞核內(nèi)未見納米顆粒(圖7)。24 h后有的納米顆粒已與細胞核膜接觸，但金納米顆粒依然主要存在于細胞質(zhì)內(nèi)，細胞核內(nèi)未見金納米顆粒(圖8)結果1、種子生長法制備金納米棒需使用表面活性劑CTAB，其具有生物毒性，本實驗采用二氧化硅為殼材包覆金納米棒，以去除CTAB的毒性。2、紫外吸收圖譜和電鏡圖片表明： 二氧化硅包覆后，對金納米棒本身的光學特性及形態(tài)結構沒有影響。3、MTT比色法實驗表明： 表面修飾后的金納米棒溶液對細胞的毒性遠小于金納米棒，對體外肝癌細胞生物安全性很好，這為我們下一步細胞實

18、驗提供了可行性。ICP-MS法測GNRSiO2-FA表面葉酸的靶向性說明：1、納米表面的葉酸具有很強的靶向性，可以在短時間內(nèi)大量與葉酸受體結合。2、納米粒子除了依靠葉酸受體介導進入細胞作用外，還可以通過胞吞作用進入細胞，只是胞吞入胞的效率相對較低。第二部分 體外細胞實驗體外粒子照射示意圖體外粒子照射示意圖圖9.GARY實驗室體外粒子照射實驗模型示意圖10Aird EG,Folkard M,Mayes CR,et al.A purpose-built iodine-125 irradiation plaque for low dose rate low energy irradiation of

19、 cell lines in vitroJ.Br J Radiol, 2001,74:56261.碘粒子模型碘粒子模型1.采用聚苯乙烯塑料圓盤直徑為1cm，厚度1mm，在圓盤底部扎出深約1mm的凹槽用來固定9粒125I粒子，1粒位于正中,8粒再距圓心30mm處環(huán)形等距離排布；2.采用細胞培養(yǎng)器皿直徑為35mm，用基礎培養(yǎng)液常規(guī)體外培養(yǎng)肝癌HepG2細胞。3.再采用同樣規(guī)格聚苯乙烯圓盤位于粒子盤的上方5mm用來放置細胞培養(yǎng)皿，粒子盤的正下方也放置一細胞培養(yǎng)皿，一同接受125I粒子照射，這樣一組粒子可以用來照射2組細胞，節(jié)約了粒子成本。4.放射防護裝置是一高度為約為100mm的拱形鉛帽Pb厚度為0

20、.50mm，同時將粒子盤和培養(yǎng)皿置入鉛帽內(nèi)，最后一同放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鉛帽的兩側稍微撐起，使其通風，細胞培養(yǎng)不受影響。在照射總時間的一半要將上下方細胞培養(yǎng)皿順時針旋轉(zhuǎn)22.5，使細胞培養(yǎng)皿所在平面接受照射的劑量率誤差減小。碘粒子模型碘粒子模型圖10a放置細胞培養(yǎng)皿125I的 b碘125粒子模型 c粒子盤上下均放置一個聚苯乙烯盤(實物) 細胞培養(yǎng)皿的125I粒子模型體外培養(yǎng)HepG2細胞空白對照組碘125粒子治療組葉酸偶聯(lián)的金納米棒組 碘125粒子+葉酸偶聯(lián)的金納米棒組倒置顯微鏡及熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率細胞免疫化學檢測bcl-2、bax、ki67蛋白表達west

21、ern-blot及RT-PCR檢測bcl-2、bax、caspase-3蛋白表達水平表3 4組肝癌HepG2細胞凋亡率比較組別例數(shù)(n)細胞凋亡率(%)空白對照組105.911.52單純金納米棒組1010.163.18單純125I粒子照射組1020.784.79*金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組1033.418.00*F值 99.82P值 0.00注：與空白對照組、單純GNRsSiO2-FA組比較，*P0.05細胞凋亡率的測定細胞凋亡率的測定圖11 流式細胞儀檢測4組細胞凋亡情況注：空白對照組；單純金納米棒組；單純125I粒子照射組；金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組結果結果1.流式細胞儀檢測細胞凋

22、亡率：金納米棒聯(lián)合放療組比單純放療組的凋亡率高。2.western-blot及RT-PCR顯示GNRsSiO2-FA+125I粒子組bcl-2明顯下調(diào)，caspase-3、bax明顯上調(diào)。3.細胞免疫化學：4組肝癌HepG2細胞凋亡相關基因Bax、Bcl-2及增殖核抗原Ki67蛋白表達量比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)；聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組Bax蛋白陽性表達率明顯升高，Bcl-2、Ki67蛋白陽性表達率明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。第三部分 體內(nèi)動物實驗實驗方法及步驟 兔兔VX2VX2肝癌模型的建立肝癌模型的建立 兔兔VX-2VX-2肝癌模型的影像學

23、檢查及病理結果肝癌模型的影像學檢查及病理結果激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實驗動物對激光掃描共聚焦顯微鏡觀察實驗動物對GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA攝取情況攝取情況 應用流式細胞儀，檢測應用流式細胞儀，檢測GNRsSiOGNRsSiO2 2-FA-FA聯(lián)合聯(lián)合 125125I I粒子內(nèi)放療的腫瘤細胞凋亡率粒子內(nèi)放療的腫瘤細胞凋亡率 兔兔VX2肝癌模型的建立肝癌模型的建立1.在無菌條件下將兔用戊巴比妥鈉（30mg/kg）靜脈全麻后手術剝離荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)腫塊，將從荷瘤兔體內(nèi)取出的生長活躍的腫瘤組織用手術剪剪碎至1-2mm3的小塊。2.實驗兔全麻后，常規(guī)肋下CT掃查待接種兔肝臟，明確兔肝

24、位置并確定待接種部位，用帶尖頭穿刺針芯穿刺針沿設定的穿刺角度、方向穿入預定肝位置，眼科鑷夾1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復1-2次。在直視下來回在針鞘內(nèi)推動平頭穿刺針芯，證實瘤塊接種于肝臟。術后連續(xù)3天青霉素40萬U+慶大霉素4萬U肌注。兔兔VX-2肝癌模型的影像學檢查肝癌模型的影像學檢查圖15. a.CT 平掃: 肝左內(nèi)葉腫瘤,呈低密度結節(jié)狀, 類圓形, 邊緣較清楚。b、c.CT 增強: 動脈期腫瘤實體部分強化明顯,其內(nèi)可見一小強化結節(jié)( 紅箭頭) ；靜脈期腫瘤強化程度低于正常肝實質(zhì)。圖16 HE染色后顯微鏡下圖象。（a）低倍光鏡下（10），正常肝組織內(nèi)見多灶浸潤性癌巢,

25、 與正常肝實質(zhì)分界清楚 。（b）高倍鏡下(40X)，可見癌細胞核大,深染 ,核分裂多，并可見少量壞死組織。兔兔VX-2肝癌模型的病理結果肝癌模型的病理結果激光掃描共聚焦顯微鏡檢測激光掃描共聚焦顯微鏡檢測GNRsSiO2-FA對肝癌細胞靶向性對肝癌細胞靶向性1.隨機將實驗動物分成三組，分為A、B、C三組，每組9只。2.A組為空白對照組: 植入腫瘤后2周，從耳緣靜脈注射生理鹽水5ml。B組為門靜脈組：在超聲引導下，辨別并確定兔門靜脈主干位置，向門靜脈內(nèi)注射GNRsSiO2-FA 200ul。C組為瘤內(nèi)注射組:在超聲引導下，向腫瘤組織內(nèi)注射GNRsSiO2-FA 200ul。3.術后24h、48h、

26、72h采用空氣栓塞法，每組各處死3只實驗兔，取其腫瘤組織和各主要臟器（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺）做后續(xù)檢測。共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對共聚焦顯微鏡觀察肝癌模型對GNRsSiO-FA攝攝取情況取情況圖17 GNRsSiO2-FA在不同組織的共聚焦圖像。（a）腫瘤組織的自發(fā)熒光和GNRsSiO2-FA熒光的發(fā)射光譜。（b）在770nm近紅外激光激發(fā)下，檢測450-550nm范圍內(nèi)的共聚焦圖像，GNRs（亮點）和腫瘤組織自發(fā)熒光都可以清楚觀察到。（c）在相同區(qū)域，當檢測范圍為650-700nm時，只有GNRs可以觀察到。（d）GNRsSiO2-FA進入腫瘤細胞內(nèi)，并在腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)積聚（藍色箭頭），

27、腫瘤細胞核內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)GNRs。圖18 在攝入GNRsSiO2-FA后不同時間段（24h、48h、72h），GNRsSiO2-FA瘤內(nèi)注射組動物體內(nèi)，腫瘤組織及各主要器官對GNRsSiO2-FA的攝取狀況。標尺=10m不同時間段不同時間段4組肝癌細胞凋亡組肝癌細胞凋亡率比較率比較組別 細胞凋亡率（%）24h48h72h1w2w3w空芯125I對照組5.435.430.710.715.525.520.380.385.325.320.670.676.016.010.440.445.715.710.490.495.315.310.660.66GNRsSiO2-FA組10.2110.210.680.68

28、* *10.7810.780.770.77* *11.3211.320.640.64* *16.2216.221.231.23* *16.2216.221.281.28* *15.3215.321.581.58* *125I 粒子植入組5.465.460.680.686.136.130.530.5312.1312.130.430.43* *18.5218.520.610.61* *27.6527.650.390.39* *25.3125.310.810.81* *聯(lián)合組10.2210.220.630.6318.2118.210.560.5625.3325.330.270.2732.2632.2

29、61.031.0344.0144.010.780.7840.7940.790.430.43*P0.05,與對照組比較；P0.05,與聯(lián)合組比較。表5 4組肝癌HepG2細胞凋亡率比較結果結果1.成功建立VX-2兔肝癌模型，CT、超聲檢查觀察顯示腫瘤血供較豐富。2.共聚焦顯微鏡觀察到實驗動物攝入GNRsSiO2-FA后，在24h內(nèi)GNRsSiO2-FA即可以特異性的與腫瘤細胞結合進入腫瘤細胞，并聚集在腫瘤細胞質(zhì)內(nèi)。3.流式細胞儀檢測4組肝癌細胞凋亡率，單純金納米棒組、單純125I 粒子照射組較空白對照組均有升高（P 0.05），聯(lián)合組較單純金納米棒組和單純125I粒子照射組明顯升高，差異有統(tǒng)計學

30、意義（P 0.05）。結論結論1. 制備成的葉酸偶聯(lián)的金納米棒探針，在細胞內(nèi)生物安全性好，并可以特異性識別肝癌細胞，葉酸受體可作為腫瘤靶向治療的理想靶點。2.GNRsSiO2-FA可以在實驗動物體內(nèi)高度靶向性作用于肝癌細胞，在腫瘤的靶向定位熱療和125I 粒子介入治療方面具有重要的應用前景。2. 納米金可增強125I對組織的輻射損傷作用，提高細胞的放射敏感性。金納米棒與125I粒子聯(lián)合應用能更有效增加肝癌細胞凋亡率。展望這種新穎的靶向納米探針在光熱治療、放療增敏和分子影像等領域具有潛在的巨大應用價值。本研究證實金納米棒聯(lián)合125I粒子具有明顯的協(xié)同抗腫瘤效果，目前國內(nèi)外對金納米棒聯(lián)合125I粒

31、子的研究尚不多見。本實驗在分子水平上為金納米棒聯(lián)合125I粒子治療肝癌提供了實驗依據(jù),但其明確生物學機制尚待更深入的研究。謝謝！靶向性實驗靶向性實驗對照組加入GNRsSiO2 100 l，實驗組加入GNRsSiO2-FA 100 l計算公式：Au元素質(zhì)量/（細胞脫水后質(zhì)量+與細胞偶聯(lián)的GNRsSiO2-FA質(zhì)量）6孔板培養(yǎng)細胞分實驗組、對照組分別加藥100ul分2、4、8、16、24h收集細胞細胞烘干至恒重稱量重量ICP-MS法測Au元素含量并計算王水溶解后配至10ml表表1 1 GNRs與與GNRsSiO2-FA對對HepG2細胞毒性測定結果細胞毒性測定結果組別GNRsSiO2-FA組GNR

32、s組 F 值 P 值 (A值) 存活率（%）(A值) 存活率（%）對照孔0.6740.0131000.6740.013100金元素濃度40.010-6組0.6220.016 92.30.398 0.012 59.1191.876 p0.0120.010-6組0.6310.021 93.60.4340.025 71.8265.419 p0.0110.010-6組0.6430.034 95.40.5430.024 80.577.987 p0.015.0 10-6組0.6650.023 98.70.5750.031 85.352.061 p0.012.510-6組0.6700.03299.40.61

33、40.03491.118.745 p0.01細胞毒性測定結果流式細胞儀檢測腫瘤流式細胞儀檢測腫瘤細胞凋亡率細胞凋亡率1.植入腫瘤后2周，隨機將實驗動物分成四組，分為A、B、C、D四組，每組6只。2.A組:單純125I粒子植入組，在CT導引下將活度為0.9mCi125I粒子植入腫瘤組織內(nèi)，植入粒子數(shù)根據(jù)粒子治療計劃系統(tǒng)（TPS）計算確定；B組:金納米棒治療組,從兔耳緣靜脈注入GNRsSiO2-FA 200L；C組：聯(lián)合治療組,在CT導引下將活度為0.9mCi 125I粒子植入腫瘤組織內(nèi)，并從耳緣靜脈注入GNRsSiO2-FA 200L；D組:對照組，在CT導引下植入相同數(shù)量的同規(guī)格的空心125I

34、粒子。3.對應的粒子植入即刻、24h、48h、72h、1w、2w、3w各組在CT導引下取距粒子0.5cm及1.5cm處瘤旁組織，處理成細胞懸液，測量細胞凋亡率。 圖 12 RT-PCR檢測金納米棒聯(lián)合125I粒子照射作用于肝癌HepG2細胞后Bax、Bcl-2、GAPDH mRNA表達注：1.DNA Marker；2.空白對照組；3.單純金納米棒組；4.單純125I粒子照射組；5.金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組 Western BlotWestern Blot檢檢測結果測結果ControlGNRsSiO2-FARadiotherapy(RT)GNRsSiO2-FA+RT Bcl-2 Caspa

35、se-3 Bax GAPDH圖13 空白對照、GNRsSiO2-FA、放療（RT）及GNRsSiO2-FA+RT對HepG2細胞中Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白表達的影響圖14 4組肝癌HepG2細胞Bax、Bcl-2、KI表達情況 注：a:空白對照組；b:單純金納米棒組；c:單純125I粒子照射組；d:金納米棒聯(lián)合125I粒子照射組（SPX400）近年來已發(fā)表的期刊近年來已發(fā)表的期刊1、鮑樂，黃鵬，高斌，崔大祥.簡便合成橢球形二氧化硅包覆的金納米棒. 東華學報(自然科學版)，2010，36(5).2.余金妹，高 斌，賀克武等.金納米棒的表面改性及生物相容性J.中國組織工程研究，2

36、012，16(38): 7068-7072.3.李愛華，高斌，賀克武，肖衛(wèi)華.橢球形金納米棒作為癌細胞靶向探針的研究J.介入放射學雜志，2013,22（4）：312-316.4.高斌，李愛華，賀克武，肖衛(wèi)華.葉酸偶聯(lián)金納米棒靶向探針制備及體外肝癌細胞對其攝取狀況的研究J.中華放射學雜志，2013，,47（7）：654-658.5.沈蕾,高斌,賀克武.金納米顆粒在腫瘤放射增敏治療中的應用：如何最大效應利用金納米棒？中國組織工程研究雜志,2014,18（39）：6369-6374.6.沈蕾,高斌，賀克武,肖衛(wèi)華.金納米棒聯(lián)合125I粒子誘導肝癌HepG2細胞凋亡及其機制的研究J.介入放射學雜志,2015,3(24):236-241.7.沈蕾,高斌，賀克武,肖衛(wèi)華.金納米棒對肝癌HepG2細胞放射增敏性影響的研究J.中華放射學雜志(2015年6月見刊).8.許軍 ,賀克武 ,高斌等.VX-2兔肝癌模型的建立及其對葉酸偶聯(lián)金納米棒攝取狀況的研究J.介入放射學雜志，2015，4（25）:345-349.9.許軍 高斌 賀克武等.葉酸偶聯(lián)金納米棒聯(lián)合125I粒子內(nèi)放療對兔VX2肝癌凋亡及其相關蛋白表達的影響J.當代介入醫(yī)學電子雜志，2015,1（1）:37-42.