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1、抗生素管碟測定法 2 儀器與用具 2.1 操作室 光線明亮，操作室應分為兩部分，彼此分開，其中一部分為一般操作室，一部分為半無菌操作室。半無菌操作室應設(shè)有紫外線滅菌燈，并附設(shè)空氣凈化（空氣凈化級別為100級～10，000級）及空調(diào)設(shè)備，控制室溫在20～25℃之間，達到無菌或半無菌狀態(tài)。操作臺應穩(wěn)固，臺面用玻璃板，并用水平儀調(diào)節(jié)至水平。注意操作，避免室內(nèi)抗生素污染。 2.2 雙碟 內(nèi)徑約90mm，高16～17mm硬質(zhì)玻璃或塑料培養(yǎng)平皿，碟底厚薄均勻，水平透明，無色斑氣泡。 碟底平度檢查，可將雙碟放在水平臺上，下墊一張白紙，碟內(nèi)加水2～3ml，再滴加藍墨水，觀察藍色深淺是否一致。 用

2、過的雙碟經(jīng)高壓滅菌倒出培養(yǎng)基后，置清洗液中浸泡過夜，沖洗，瀝干，至150℃～160℃干熱滅菌2小時或高壓121℃蒸氣滅菌30分鐘，備用。 2.3 陶瓦蓋 內(nèi)徑約103mm，外徑108mm，平坦，吸水性強，應定期清洗、干燥或干熱滅菌。 2.4 鋼管 內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10.0±0.1）mm；外徑（8.0±0.1）mm或（7.8±0.1）mm，每套鋼管重量差異不超過±0.05g，內(nèi)外壁及兩端面光潔平坦，管壁厚薄一致。每次使用后應置1:1000新潔爾溶液內(nèi)，浸泡2小時以上，滅菌后再洗滌，先用水洗滌，超聲波超聲30分鐘或用沾有去污粉的紗布條串擦內(nèi)外壁，水沖洗，瀝干，再用蒸餾水沖洗

3、3次后，置帶蓋的容器內(nèi)，在150℃～160℃干熱滅菌2小時，備用。 2.5 鋼管放置器 有6孔和4孔兩種。放置于無菌或半無菌室的操作平臺上，鋼管下落時應垂直平穩(wěn)、位置正確。雙碟升降平穩(wěn)。應保持清潔，防止抗生素污染?？啥ㄆ谟?5%乙醇棉擦拭落管筒及儲管杯。置鋼管的玻璃管應定期干烤滅菌。 2.6 恒溫培養(yǎng)箱 以隔水式為宜，溫度平穩(wěn)，波動小。設(shè)置漂移溫度為35～37℃或24～26℃，依各品種要求而定，箱內(nèi)網(wǎng)狀隔板上放置帶孔的玻璃板并調(diào)整水平。 2.7 滅菌刻度吸管 用于吸取菌液及培養(yǎng)基。使用后應立即置5%石炭酸或1:1000新潔爾溶液中消毒后，再按玻璃容器的常規(guī)洗滌法洗滌。洗滌瀝干后在吸

4、口處塞入脫脂棉（松動，透氣），置適宜容器中，在120℃以上干熱滅菌2小時或121℃蒸氣滅菌30分鐘，烘干備用。 2.8 玻璃容器 包括定量移液管、刻度吸管、容量瓶等，均應符合“常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”的規(guī)定。每次使用前用清潔液浸泡，水沖洗，并用蒸餾水或去離子說沖洗3次，瀝干。 2.9 稱量瓶 重量在10g以下。用畢先用水沖洗、瀝干，置清潔液浸泡2小時以上，然后分別用水、蒸餾水或去離子說沖洗3次，置潔凈平皿中，在120℃干熱滅菌3小時，待冷至60～70℃時，取出置于干燥中備用。 2.10 滴管 用玻璃管拉制，管口光滑。使用前在清潔液浸泡，分別用水、蒸餾水后去離子水沖洗3次，置適

5、宜容器中，在120℃干燥3小時后備用。 2.11 天平 分析天平，精密度0.1mg，經(jīng)計量檢定。 2.12 抑菌圈直徑（面積）測量儀 應符合“抑菌圈測量儀檢定規(guī)程”的規(guī)定。 2.13 游標卡尺 精度0.05mm，長度125mm。 2.14 超凈工作臺 有效工作面局部 潔凈度100級。用于試驗菌的接種傳代或菌懸液制備。超凈工作臺須置潔凈工作室或半無菌室內(nèi)。 3 試液 3.1 滅菌緩沖液 制備緩沖液的試劑應為分析純，配制后的緩沖液應澄明，分裝于玻璃容器內(nèi)，經(jīng)121℃蒸氣滅菌30分鐘備用。 3.1.1 磷酸鹽緩沖液（pH6.0） 取磷酸氫二鉀2g與磷酸二氫鉀8g，加水使成

6、1000ml，濾過。 3.1.2 磷酸鹽緩沖液（pH7.0） 取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）9.39g與磷酸二氫鉀3.5g，加水使成1000ml，濾過。 3.1.3 磷酸鹽緩沖液（pH7.8） 取磷酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g，加水使成1000ml，濾過。 3.1.4磷酸鹽緩沖液（pH10.5） 取磷酸氫二鉀35g，加氫氧化鉀液，加水使成1000ml，濾過。 4 培養(yǎng)基 配制培養(yǎng)基的各成分原料質(zhì)量對抑菌圈邊緣清晰度及試驗結(jié)果影響較大，因此應對原材料進行預試驗，挑選適當?shù)钠放剖褂谩? 制成的培養(yǎng)基不應有沉淀，如產(chǎn)生沉淀，可在配制培養(yǎng)基后，于115℃加熱20分鐘溶

7、化，趁熱用紙漿減壓或適宜方法過濾，調(diào)整pH值，分裝滅菌備用。 中國藥典2005年版二部附錄的抗生素生物檢定法中收載了13種不同處方的培養(yǎng)基及制備方法。目前，已有市售干燥培養(yǎng)基，使用方便。臨用時按照使用說明進行配制，但應注意核對培養(yǎng)基的pH，必要時需調(diào)節(jié)pH，使其符合規(guī)定。另外，市售干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量也存在差異，注意選擇合適的產(chǎn)品。 5 試驗菌 5.1 菌種的復蘇 檢定用標準菌種為冷凍干燥品，由中國藥品生物制品檢定所提供。 5.1.1 取凍干菌種管、滅菌1ml毛細滴管、雙碟、鑷子、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面，移入接種室操作臺或超凈工作臺。 5.1.2 將凍干菌種管外壁用碘酒（碘狀）擦

8、拭消毒，稍干，用75%乙醇棉球擦凈，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干。點燃酒精燈，將菌種管的封口一端在火焰上燒灼紅熱，用滅菌毛細滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，滴在上述灼熱的菌種管封口端，使其驟冷炸裂。 5.1.3 取滅菌鑷子，在酒精燈火焰上方，將炸裂的管口打開，放入滅菌雙碟內(nèi)，另取1支滅菌毛細滴管，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許，加至菌種管底部，將凍干菌塊攪動是其溶解，隨即吸出管內(nèi)菌液，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將毛細滴管及菌種管投入消毒液內(nèi)，將已接種的營養(yǎng)瓊脂斜面置35～37℃培養(yǎng)22～24小時。 5.1.4 取出培養(yǎng)物，仔細觀察菌苔形態(tài)、有無雜菌，涂片并進行革蘭氏染色鏡檢，如呈典型菌落，則轉(zhuǎn)種3代

9、即可使用。菌落不典型時，可進行平板分離單菌落。 5.2 菌種的接種與保存 5.2.1 準備需用的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基應新鮮制備，如斜面已無冷凝水者，不宜再使用。在標簽上注明菌名及接種日期。從冷藏箱中取出菌種斜面后，應在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺。 5.2.2 點燃酒精燈或煤氣燈等，左手握住菌種斜面，將管口靠近火焰上方，右手拿接種棒后端，將接種環(huán)燒紅約30秒種，隨后將接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次。右手用無名指、小指及掌部夾住管塞，左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼，右手再輕輕拔開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上，刮取少量菌苔，

10、隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰上方。塞上管塞，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支，照上述操作打開管塞，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的底部，由底向上，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折蛇形移動，使細菌接種在斜面的表面上。 5.2.3 取出接種環(huán)，在火焰上方將培養(yǎng)基管蓋上塞子，然后將接種過細菌的接種環(huán)在火焰上燒灼滅菌。 5.2.4 將已接種的細菌管置35～37℃培養(yǎng)22～24小時，霉菌管一般置24～25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7天。培養(yǎng)后放入4℃冷藏箱內(nèi)保存，一般1～3個月轉(zhuǎn)種一次。 5.3 菌懸液的制備 5.3.1 枯草芽孢桿菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63 501]懸

11、液 取枯草芽孢桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，加滅菌水1～2ml將菌苔洗下，制成懸液，用吸管將此懸液接種至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶內(nèi)，均勻攤布，在35～37℃培養(yǎng)7天。取菌苔少許涂片，革蘭氏染色鏡檢，應有芽孢85%以上，用滅菌水10ml將芽孢洗下，制成芽孢懸液，合并至滅菌大試管內(nèi)，在65℃水浴中加熱30分鐘將菌體殺死，待冷后置4℃冷藏箱貯藏。此菌液為濃菌液。 日常試驗用菌液 取上述濃溶液，用滅菌水1:3稀釋至滅菌試管中，冷藏箱保存?zhèn)溆谩? 5.3.2 短小芽孢桿菌[Bacillus subtilis CMCC（B）63 202]懸液 取短小芽孢桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照

12、上述方法制備芽孢懸液。 5.3.3 金黃色葡萄球菌[Staphylococus aureusCMCC（B）26 003]懸液 取金黃色葡萄球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種至營養(yǎng)瓊脂斜面上，在35～37℃培養(yǎng)22～24小時，臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，制成懸液。置4℃冷藏箱保存，可使用3天。 5.3.4 藤黃微球菌[Micrococcus luteus CMCC（B）28 001]懸液 取藤黃微球菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，用1ml培養(yǎng)基Ⅲ將菌苔洗下，用吸管移至盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的扁培養(yǎng)瓶中，均勻攤布，將培養(yǎng)瓶倒置于培養(yǎng)箱中26～27℃培養(yǎng)24小時取出，用吸管

13、吸取培養(yǎng)基Ⅲ或0.9%滅菌氯化鈉溶液5ml至培養(yǎng)瓶中，將菌苔洗下，合并菌液至滅菌大試管中備用。置4℃冰箱中保存，可使用1～2個月。 5.3.5 大腸桿菌[Eschehchia coli CMCC（B）44 103]懸液 取大腸桿菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制備菌懸液，供當日使用。 5.3.6 肺炎克雷伯氏菌[Klebosiella pneumoniae CMCC（B）46 117]懸液 取肺炎克雷伯氏菌工作用菌種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，照金黃色葡萄球菌菌懸液項下的方法制備菌懸液，供當日使用。 5.3.7 啤酒酵母菌[Saccharomyces cere

14、visiae9736]懸液 取啤酒酵母菌的V號培養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物，用接種環(huán)取菌苔少許接種于Ⅳ號培養(yǎng)基斜面上，在32～35℃培養(yǎng)24小時，用滅菌水將菌苔洗下，放至含有滅菌玻璃珠的試管中，振搖均勻，以當日使用為宜。 試驗菌的菌齡對抑菌圈邊緣清晰度有一定影響，應保持菌種新鮮。對易變異的菌株如藤黃微球菌等，宜在制備菌液前進行單菌落的分離，選擇典型菌落以保持菌懸液中菌群的一致性，以使所得的抑菌圈邊緣清晰、整齊。 6 操作法 6.1 稱量 6.1.1 稱量前先將標準品從冰箱中取出，使其溫度與室溫平衡。 6.1.2 供試品與標準品 的稱量應使用用一架天平；對于吸濕性較強的抗生素，應在稱量前1～

15、2小時更換天平內(nèi)干燥劑。 6.1.3 標準品與供試品的稱量盡量一次取樣稱取，不得將已取出的稱取物倒回原容器內(nèi)。標準品的稱取量不得少于20mg，取樣后立即將盛有樣品的稱量瓶或適宜的容器用蓋蓋好，以免吸水。 稱樣量的計算： W= V·C P 式中W為需稱取標準品或供試品的重量（mg）； V為溶解標準品或供試品制成濃溶液時用容量瓶的體積（ml）； C為標準品或供試品濃溶液的濃度（u/ml或μg/ml）； P為標準品的純度或供試品的估計效價（u/mg或μg/mg）。 6.2 稀釋 稀釋操作應

16、遵照容量分析的操作規(guī)程進行。 6.2.1 用于溶解及稀釋標準品或供試品的容量瓶和移液管等玻璃量器，應按“常用玻璃量器國家計量檢定規(guī)程”進行標定，符合A級的要求。每步稀釋，量取量不得少于2ml，稀釋步驟一般不超過3步。 舉例：量取貯備液（1000u/ml），進行以下稀釋。 50ml量瓶，稀釋至刻度 第一步 精密量取5ml（1000u/ml） 100 u/ml 50ml量瓶，稀釋至刻度 第一步 精密量取5ml（1

17、000u/ml） 10 u/ml（H） 100ml量瓶，稀釋至刻度 第一步 精密量取5ml（1000u/ml） 5 u/ml（L） 6.2.2 量取供試品溶液盡量使用刻度移液管，正式量取前要用供試液流 洗2～3次，吸取供試溶液后，用濾紙將外壁多余液體拭去，從起始刻 度開始放溶液。 6.2.3 標準品溶液和供試品溶液應使用同一緩沖液（溶劑）稀釋，以避免因pH或濃度不同而影響測定結(jié)果。 6.2.4稀釋時，每次加液至接近量瓶刻度前，稍放置片刻

18、，待瓶壁的液體完全流下，再準確補加至刻度。 6.2.5 二劑量（2.2）法的標準品溶液及供試品溶液高、低濃度之比為1:0.8。但所選用的濃度必須在劑量反應直線范圍內(nèi)。 6.3 雙碟制備 6.3.1 雙碟的制備應在半無菌室或潔凈室內(nèi)進行，并注意避免微生物及抗生素的污染。培養(yǎng)基應在水浴中或微波爐內(nèi)融化，避免直火加熱。 6.3.2 底層 用滅菌大口20ml吸管或其他滅菌分裝器，吸取已融化的培養(yǎng)基20ml注入雙碟內(nèi)，待凝固后更換干燥的陶瓦蓋，放置于35～37℃培養(yǎng)箱中保溫，使菌層易于攤布。 6.3.3 菌層 取出試驗用菌懸液，按預試好的加菌量[（2.2）法標準品溶液的高濃度所致的抑菌直徑

19、在18～22mm，（3.3）法標準品溶液的中心濃度所致的抑菌圈直徑在15～18mm]，用滅菌吸管吸取懸液適量，加入已融化并保溫在水浴中（水浴溫度，細菌為48～50℃。芽孢可至60℃）的培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，作為菌層培養(yǎng)基用。取出加有底層培養(yǎng)基的雙碟，用滅菌大口5ml、10ml吸管或其他適宜分裝器，吸取菌層培養(yǎng)基5ml，加于底層培養(yǎng)基上，使其均勻攤布，用干燥陶瓦蓋覆蓋，放置20～30分鐘，待凝固。 6.3.4 放置鋼管 用鋼管放置器，將滅菌的鋼管放入貯管筒（杯）內(nèi)，按說明書的要求操作，使鋼管平穩(wěn)地落在培養(yǎng)基上，注意使各鋼管下落的高度基本一致。如無鋼管放置器，可用小眼科鑷子夾持鋼管，輕輕地放置在培養(yǎng)

20、基上，相應劑量的鋼管對角均勻放置。鋼管放妥后，應使雙碟靜置5～10分鐘，鋼管在瓊脂上沉穩(wěn)后，再開始滴加抗生素溶液。 6.4 滴加抗生素溶液 6.4.1 每批供試品取不少于6個雙碟，滴加溶液用滅菌毛細滴管或微量加樣器（調(diào)節(jié)加樣量約為200～300μl），在滴加之前須用溶液洗2～3次。 6.4.2 滴加標準品及供試品溶液順序，因?qū)嶒炘O(shè)計方法不用而異。（2.2）法，在雙碟的4個鋼管中分別成“Z”字形滴加標準品（S）及供試品（T）高（H）、低（L）兩種濃度的溶液，即滴加溶液的順序為SH－TH－TL－SL；（3.3）法的6個鋼管中間隔3個鋼管中分別滴加標準品及供試品高（H）、中（M）、低（L）3種

21、濃度溶液，并使相同濃度成對角，滴加順序為SH－TH－SM－TM－SL－TL。 滴加溶液至鋼管口平滿，注意滴加溶液的間隔不可過長，否則因鋼管內(nèi)溶液的擴散時間不同會影響測定結(jié)果。 6.4.3 每份滴加的溶液為同一單位，但雙碟數(shù)每次不超過5個，如果1份溶液滴加雙碟數(shù)目多，可分次滴加。每種溶液各用1支毛細滴管。 6.4.4 滴加完畢，用陶瓦蓋覆蓋雙碟，平穩(wěn)置于雙碟托盤內(nèi)，雙碟疊放不可超過3層，以免受熱不均，影響抑菌圈大小。將雙碟托盤水平平穩(wěn)地移入培養(yǎng)箱中間位置，在35～37℃或該藥品標準規(guī)定的溫度下培養(yǎng)至所需時間。 6.5 抑菌圈測量 6.5.1 將培養(yǎng)好的雙碟取出，拿掉陶瓦蓋，將鋼管倒入盛

22、有1:1000新潔爾滅（苯扎溴銨）溶液或其他消毒液內(nèi)滅菌，換以玻璃蓋；測量抑菌圈前，應檢查抑菌圈是否圓整，如有破圈或圈不圓整，應舍棄該碟，切忌主觀挑選雙碟或抑菌圈，以免造成測定結(jié)果的偏倚。 6.5.2 測量抑菌圈可以使用抑菌圈測量儀，也可用游標卡尺；使用的抑菌圈測量儀應經(jīng)過檢定，并符合檢定規(guī)程的要求，操作時應按儀器的操作規(guī)程進行：使用游標卡尺測量時，眼睛視線應與讀數(shù)刻度垂直，用卡尺的尖端與抑菌圈直徑的切點成垂直方向測量。 7 記錄與計算 7.1 記錄 試驗記錄應包括抗生素藥品名稱、規(guī)格、批號、生產(chǎn)廠、檢查編號、檢查依據(jù)、檢驗日期、溫度、相對濕度、標準品名稱、標準品批號、標準品來源及標準

23、品標示含量、試驗菌名稱及菌懸液濃度、培養(yǎng)基名稱、來源及批號、緩沖液名稱及pH、供試品估計效價、抑菌圈測量儀型號及編號、標準品與供試品的稱量、稀釋步驟、試驗人與校核人、抑菌圈測量及數(shù)據(jù)處理結(jié)果。當用游標卡尺測量抑菌圈直徑時，應將測得數(shù)據(jù)按相應劑量濃度以列表形式記錄。用測量儀測量抑菌圈面積或直徑時，應將儀器的測量、數(shù)據(jù)處理、統(tǒng)計分析及計算結(jié)果打印后貼附于記錄頁上。 7.2 計算 7.2.1 二劑量法（2.2法）效價計算公式 P=log-1[T2+T1－S2－S1 =I]×100% T2+S2－T1－S1 式中 P為供試品效價（相當于標示量

24、或估計效價的百分數(shù)）； S2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T2為標準品高濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T1為標準品低濃度溶液所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； I為高、低劑量之比的對數(shù)值，2:1時，I=0.301。4:1時，I=0.602。 舉例 乳糖酸紅霉素效價測定結(jié)果計算（見表1） 表1 抑菌圈面積測量結(jié)果 抑菌圈面積 碟數(shù) S1

25、 S2 T2 T1 1 1571 1276 1581 1268 2 1481 1199 1523 1173 3 1523 1302 1497 1263 4 1518 1214 1533 1226 5 1573 1237 1543 1

26、268 6 1546 1219 1580 1224 7 1495 1260 1526 1240 8 1530 1237 1548 1263 9 1605 1256 1593 1293 10 1649 1272 1608 1320 ∑ 15491

27、12472 15532 12528 估計效價（AT）=603u/mg 劑距（I）=0.301 P=log-1[15532+12528-15491-12472 ×0.301]×100%=101.1% 15491+15532-12472-12528 效價（PT）=P×AT=603u/mg×101.1%=609.8u/mg 7.2.2 三劑量法計算公式 P=log-1[0.1292（T3+T2+T1－S3－S2－S1）]×100% S3+T3－S1－T1 式中 S3為標準品高濃度所致抑菌圈直徑（或

28、面積）的總和； S2為標準品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； S1為標準品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T3為供試品高濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T2為標準品中間濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； T1為標準品低濃度所致抑菌圈直徑（或面積）的總和； I為高、低濃度劑量之比的對數(shù)值，1:08時，I=0.0969。 舉例 新霉素效價測定結(jié)果計算（見表2）。 表2 抑菌圈直徑測量結(jié)果 抑菌圈直徑 碟數(shù) S1

29、 S2 S3 T1 T2 T3 1 16.05 16.20 16.50 15.80 16.35 16.60 2 16.20 16.45 16.65 16.20 16.45 16.70 3 16.00 16.45 16.70 16.05 16.35 16.70 4 15.95 16.35 16.60 16.00 16.25 16.60 5 15.70

30、 16.25 16.60 15.85 16.25 16.60 6 15.55 16.20 16.55 15.70 16.20 16.60 7 15.65 16.20 16.40 15.80 16.15 16.40 8 15.90 16.10 16.45 15.80 16.10 16.50 9 15.60 16.00 16.30 15.70 15.95 16.30 ∑ 142.60 146

31、.20 148.75 142.90 146.05 149.00 估計效價（AT）=670u/mg 劑距（I）=0.0969 P=log-1[0.1292（142.9+146.05+149.00-142.6-146.2-148.75]×100% 148.75+149.00-142.6-142.9 P=101.1% 效價（PT）=P×AT=101.1%×670u/mg =676.7u/mg 8 結(jié)果判定 8.1 可靠性測驗 管碟法系根據(jù)量反應平行線原理而設(shè)計，并要求在試驗所用的劑量（濃度）范圍內(nèi)，對數(shù)劑量（濃度）與反應呈直線關(guān)系?？煽啃詼y驗即通過對劑間變異的分析，

32、以測驗標準品和供試品的對數(shù)劑量與反應的關(guān)系是否顯著偏離平行直線。（2.2）法的劑間變異分析為試品間、回歸和偏離平行三項；（3.3）法還需再分析二次曲線和反向二次曲線，如用游標卡尺測量抑菌圈直徑，可用（2.2）法和（3.3）法的專用數(shù)據(jù)處理軟件對測量數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理和結(jié)果計算。用抑菌圈測量儀測量抑菌圈時，測量與統(tǒng)計學處理一次完成，統(tǒng)計學分析按藥典附錄的生物檢定統(tǒng)計法進行F的顯著性測驗。（2.2）法要求直線回歸和劑間要非常顯著（P<0.01），偏離平行不應顯著（P>0.05）；（3.3）法除（2.2）法的上述規(guī)定外，尚需考察二次曲線和反向二次曲線，且二者均應不顯著（P>0.05），符合以上各項規(guī)

33、定后，才能認為試驗結(jié)果可靠，方可進行效價和可信限率計算。 8.2 可信限率 考核試驗的精密度。除藥典各論另有規(guī)定外，管碟法的可信限率不得超過5%。 上述各項都能符合者，試驗結(jié)果成立。 8.3 試驗計算所得效價低于估計效價的90%或高于估計效價的110%，則檢驗結(jié)果僅作為初試，應調(diào)整供試品估計效價，予以重試。 8.4 原料藥效價測定一般需做雙份樣品平行試驗，以使核對。對于檢驗結(jié)果不符合規(guī)定的樣品，應有可靠性測驗及可信限率均符合規(guī)定，且測定結(jié)果在估計效價（原料藥）或標示量（制劑）±10%范圍內(nèi)的至少2個效價測定結(jié)果，必要時應請其他檢驗人員復核，才能發(fā)出檢驗報告。 8.5 效價測定結(jié)果的

34、有效數(shù)字按藥典規(guī)定及數(shù)字的原則取舍。 9 操作要點 9.1抗生素原料藥 不含輔料的藥物制劑原料，一般其效價以純度（u/mg或μg/mg）表示。檢驗時，可參考該品種的藥品標準純度限度規(guī)定或廠方提供的純度估計效價，取樣試驗，如估計效價與實際效價相差較遠時，即測定所得效價超出估計效價的±10%時，則重新估計效價，再做準確測定。 原料藥一般皆以干燥品或無水物折算效價，須先測其含水或未折干效價，再根據(jù)供試品的水分或干燥失重測定結(jié)果折算成無水物或干燥品的效價。 干燥品或無水物效價（u/mg）= 濕品（或未折干品）效價（u/mg）

35、 1-供試品干燥失重或水分% 9.2 抗生素制劑 9.2.1 粉針劑 指注射用無菌粉末或凍干品，用西林瓶橡膠塞鋁蓋封裝或熔封在安瓿內(nèi)，一般測定其純度（u/mg或μg/mg）或整瓶效價。 取裝量差異項下的內(nèi)容物，稱取適量（50mg以上，根據(jù)標示量及平均裝量折算估計效價，并按估計效價及量瓶體積計算取樣量），置量瓶中，加標準中規(guī)定的溶劑溶解，稀釋，測定，計算出1mg的效價單位數(shù)，再根據(jù)平均裝量及標示量計算平均每瓶的百分含量。 9.2.2 水針劑（注射液） 即抗生素的滅菌水溶液，標示量一般按每毫升含效價單位計。效價測定時，量取平均裝量項下的內(nèi)容物或5～10支的內(nèi)容物，混勻，用干燥的刻度吸管

36、吸取一定量的供試品，將吸管外壁用濾紙拭凈，再棄去多余的溶液，使供試品至吸管刻度，沿量瓶頸部內(nèi)壁緩緩流放入已盛有一定量溶劑（以免抗生素結(jié)晶析出）的量瓶內(nèi)，混勻，繼續(xù)加溶劑至刻度，搖勻，再量取適量稀釋至規(guī)定的濃度。 9.2.3 片劑 包括素片、薄膜衣片、糖衣片及腸溶片。 素片、薄膜衣片 稱取20片的總量，求出平均片重，研細混勻后，精密稱取適量（約相當于1片的重量或根據(jù)標示量按平均片重及所用量瓶體積折算取樣量），置量瓶中，用標準中規(guī)定的溶劑溶解，并稀釋至刻度，搖勻。再量取適量稀釋至規(guī)定濃度。 注意點：研磨時應注意環(huán)境干燥，可在干燥操作柜內(nèi)操作，研磨要迅速，避免吸濕，因片劑內(nèi)含輔料較多，輔料可

37、能漂浮于溶液表面，稀釋時量取供試溶液應讀取輔料下層的溶液切面；如沉淀較多，須待其下沉后再量取上層液；有些輔料吸附抗生素，應加以注意。為節(jié)約供試品，可與重量差異檢查結(jié)果進行。 糖衣片、腸溶片 取標準中規(guī)定的片數(shù)，置于乳缽中，研細，分次加入規(guī)定的溶劑，研磨使其溶解，將研磨液轉(zhuǎn)移至瓶口放有小漏斗的量瓶中，量瓶體積根據(jù)供試品標示量、所取片數(shù)及抗生素儲備液濃度（一般為1000單位/ml）選定，用規(guī)定溶劑稀釋至刻度，搖勻，靜置，使輔料下沉而抗生素已溶解在溶液內(nèi)，精密吸取量瓶中的上層液適量，作進一步稀釋。個別品種標準如同時收載了糖衣片和薄膜衣片，可能規(guī)定薄膜衣片也取整片制備供試品溶液。 9.2.4 膠囊

38、劑 取裝量差異項下的內(nèi)容物，混合均勻，研細，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當于1粒膠囊的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻，如供試品含有較多的輔料，則照片劑項下的方法進行。 9.2.5 顆粒劑、干混懸劑 取裝量差異項下的內(nèi)容物，混勻，根據(jù)平均裝量，精密稱取約相當于1袋（包）的量或按標示量、量瓶體積及抗生素儲備液濃度等計算的取樣量，置于量瓶中，加規(guī)定的溶劑溶解并稀釋至刻度，搖勻。量取適量稀釋制成供試品溶液。測得效價后，再根據(jù)裝量差異項下的平均裝量，計算出平均每袋（包）的效價，根據(jù)標示量即可算出含量。 9.2.6 軟膏劑、眼膏

39、劑 擦凈軟膏劑或眼膏劑軟管的外壁，切開封口，置于干燥器內(nèi)約1小時，取干燥的潔凈分液漏斗，帶手套操作，將膏劑軟管連同內(nèi)容物在天平上稱重，取出，將內(nèi)容物擠入分液漏斗，量約2g，再稱取膏劑軟管的重量，按減重法以前后稱量之差計算分液漏斗內(nèi)膏劑供試品的量，以不號過氧化物的乙醚或石油醚等作溶劑溶解基質(zhì)，但基質(zhì)中抗生素則應不溶于或幾乎不溶于該有機溶劑中，以避免提取過程中抗生素的損失。按標準中的規(guī)定加提取溶劑至分液漏斗中，振搖，使基質(zhì)溶解，用規(guī)定的緩沖溶液提取抗生素至說相中，用緩沖溶液提取3次，合并3次的提取液，置量瓶中，加緩沖溶液至刻度，搖勻，量取適量稀釋至規(guī)定的濃度，滴加雙碟，培養(yǎng)，測量抑菌圈，數(shù)據(jù)處理

40、，可靠性測驗及可信限率判斷，計算效價。 抗生素微生物比濁法 10 儀器與用具 10.1 操作室 要求同管低法 10.2 分光光度計 應有數(shù)字顯示功能和自動記錄裝置，數(shù)顯精度應在小數(shù)點后三位。 10.3 玻璃大試管 20.5mm×2.5mm或適宜的試管，應大小一致，厚薄均勻，玻璃質(zhì)地相同，使用同一品牌和批號。使用過的試管經(jīng)滅菌后，將培養(yǎng)基傾出，用水清洗，瀝干，再用硫酸－重鉻酸鉀洗液浸泡，清水沖洗干凈后，晾干，在160℃干烤2～3小時滅菌，保持潔凈，備用。注意避免污染毛點、纖維等，以免干擾測定結(jié)果。 10.4 移液管 10ml或20ml刻度容量，管口需磨粗（大），以便快速分

41、裝培養(yǎng)基。 10.5 恒溫水浴箱 工作體積600mm×300mmmm×150mm（長×寬×高）。電熱恒溫水浴。 10.6 電動攪拌器 將二臺電動攪拌器的槳葉置于恒溫水浴的大試管隨機區(qū)組培養(yǎng)方列的兩側(cè)，于水中攪動，以使水溫均勻。本身帶有攪拌或循環(huán)水系統(tǒng)的恒溫水浴箱，可不再配備電動攪拌器。 10.7 分光光度計用吸收池 方形玻璃吸收池或石英吸收池，透光面1cm，用硝酸－硫酸混合液（取濃硫酸95ml，加濃硝酸3～5ml，混勻）浸泡1～48小時（浸泡時間視是否能去除附著污物而定），先后用水、去離子水（蒸餾水）沖洗干凈，晾干，備用。如仍不能除去附著污物，可用1%～2%硝酸鈉的濃硫酸溶液浸泡后

42、，再經(jīng)水洗滌。 10.8 其他 分析天平、稱量瓶、量瓶、25ml及50ml滴定管、秒表、濾紙及鏡頭紙等。 11 試管 除同管碟法的要求外，比濁法用的緩沖液應澄清無色，緩沖液配制后用垂熔玻璃漏斗濾過，除去沉淀等不溶物，使溶液澄清。使用前滅菌。 12 培養(yǎng)基 除同管碟法的要求外，比濁法使用的培養(yǎng)基應澄清，顏色以盡量淺為佳，培養(yǎng)后培養(yǎng)基本身不得出現(xiàn)渾濁。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后不得發(fā)生沉淀。根據(jù)這一原則，通過對培養(yǎng)基原材料的預試，挑選合適品牌廠家的產(chǎn)品使用。目前，已有一些種類的市售干燥培養(yǎng)基，如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基等，使用方便。 13 試驗用菌液 13.1金黃色葡萄球菌（Staphy

43、lococus aureus）懸液 取金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在35～37℃培養(yǎng)20～22小時。臨用時，用滅菌水或0.9%滅菌氧化鈉溶液將菌苔洗下，備用。 13.2 大腸桿菌（Eschehchia coli）懸液 取大腸桿菌[CMCC（B）44 103]的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，在35～37℃培養(yǎng)20～22小時。臨用時，用滅菌水將菌苔洗下，備用。 13.3 白色念珠菌（Candida albicans）懸液 取白色念珠菌[CMCC（F）98 001]的改良馬丁瓊脂斜面的新鮮培養(yǎng)物，接種于10

44、ml培養(yǎng)基Ⅸ（中國藥典2005年版二部附錄Ⅺ A 抗生素微生物檢定法）中，在35～37℃培養(yǎng)8小時，再用培養(yǎng)基Ⅸ稀釋至適宜濃度，備用。 14 操作方法 14.1 稱量 要求同管碟法。 14.2 稀釋 標準品與供試品溶液的稀釋應使用經(jīng)標定的量瓶，每步稀釋的量取量以不少于2ml為宜，稀釋步驟一般不超過3步。 14.3 標準曲線法 14.3.1 標準品溶液 按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標準品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應線性范圍內(nèi)，以線性濃度范圍的中間值作為中間濃度，標準品溶液選擇5個劑量，劑量間的比例應適宜（通常為1:1.25或更?。?。 14.3.2

45、供試品溶液 根據(jù)估計效價或標示量，取供試品按標準品溶液的制備方法，選擇中間濃度，不少于3個試管。 14.3.3 含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備 臨用前，取規(guī)定的試驗菌懸液適量（35～37℃培養(yǎng)3～4小時后測定的吸光度在0.3～0.7之間），加入到各液體培養(yǎng)基管中，混合均勻，使在試驗條件下能得到滿意的劑量－反應關(guān)系和適宜的測定濁度（吸光度）。含試驗菌液體培養(yǎng)基在配制后應立即使用，必要時可適當冷卻，以防止試驗菌在培養(yǎng)前生長。 14.3.4 線性試驗 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，再各個試管內(nèi)分別精密加入各個濃度的標準品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即

46、混勻，按隨機區(qū)組分配將各個試驗管放置于恒溫水浴內(nèi)，在規(guī)定的條件下培養(yǎng)（通常約4小時）至適宜測量的濁度值（吸光度值）。各濃度不少于4個試管。 14.4 平行線測定法（二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法） 14.4.1 標準品溶液 按中國藥典該品種含量測定項下的要求，制成一定濃度的標準品貯備液。在該品種項下規(guī)定的劑量反應線性范圍內(nèi)，選擇2個或3個劑量，劑量間的比例應適宜（二劑量通常為2:1或4:1，三劑量通常為1:0.8）。 14.4.2 供試品溶液 根據(jù)估計效價或標示量，取供試品按標準品溶液的制備方法，選擇2個或3個劑量。 14.4.3 含試驗菌液體培養(yǎng)基的制備 同14.3.3配

47、制方法。 14.4.4 標準品及樣品測定 取適宜的大小厚度均勻的已滅菌試管，在各個試管內(nèi)分別精密加入2個或3個濃度的標準品和供試品溶液各1.0ml，再精密加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，立即混勻，按隨機區(qū)組分配將各管在規(guī)定條件下培養(yǎng)至適宜測量的濁度值（通常約為4小時）。各濃度不少于4個試管。 14.5 空白試驗 另取2支試管各加入藥品稀釋劑1.0ml，再分別加入含試驗菌的液體培養(yǎng)基9.0ml，其中在一支試管中立即加入12%甲醛溶液0.5ml，混勻，作為空白對照，另一支試管同法培養(yǎng)作為試驗菌生長對照。 14.6 吸光度的測量 在線測定各試管的吸光度，或取出試管立即加入12%甲醛溶

48、液0.5ml以終止微生物的生長，在530nm或580nm波長處測定各管的吸光度。 15 記錄與計算 15.1 試驗記錄要求與管碟法相同。 15.2 標準曲線法 15.2.1 效價計算 按下式計算的標準曲線的斜率b和截距a，從而得到相應的標準曲線行性方程。 斜率（b）=∑（x－ⅹ）∑（y－y） ∑（x－ⅹ）2 截距（a）=y－bx 標準曲線線性方程 Y=bX＋a 式中 x為抗生素標準品溶液的濃度或濃度的數(shù)學轉(zhuǎn)換值； X為抗生素標準品溶液的濃度或濃度的數(shù)學轉(zhuǎn)換值的平均值； y為各標準品溶液的吸光度； y為標準品溶液吸光度

49、的平均值。 計算各濃度試管供試品溶液吸光度的平均值，自標準曲線上或按標準曲線的線性方程，求得抗生素的量，再乘以供試品溶液的稀釋度，即得供試品中抗生素的效價含量。 15.2.2 回歸系數(shù)的顯著性檢查 判斷回歸得到的方程是否成立，即X、Y是否存在著回歸關(guān)系，可采用t檢驗。X、Y應具有直線回歸關(guān)系。 15.2.3 可信限率 考核試驗的精密度，除藥典各論另有規(guī)定外，本法的可信限率不得超過5%。 上述各項規(guī)定都能符合者，試驗結(jié)果成立。 15.3 平行線測定法 15.3.1 效價計算 15.3.1.1 二劑量（2.2）法效價計算公式 P=log-1[T2＋T1－S2－S1）×I]×10

50、0% T2＋S2－T1－S1 式中 P為供試品效價（相當于標示量或估計效價的百分數(shù)）； S2為標準品高濃度溶液所致吸光度的總和； S1為標準品低濃度溶液所致吸光度的總和； T2為標準品高濃度溶液所致吸光度的總和； T1為標準品低濃度溶液所致吸廣度的總和； I為高、低劑量之比的對數(shù)值，2:1時，I=0.301。4:1時，I=0.602。 15.3.1.2 三劑量（3.3）法效價計算公式 P=log-1[0.1292（T3+T2+T1－S3－S2－S1）]×100%

51、 S3+T3－S1－T1 式中 S3為標準品高濃度所致吸光度的總和； S2為標準品中間濃度所致吸光度的總和； S1為標準品低濃度所致吸光度的總和； T3為供試品高濃度所致吸光度的總和； T2為標準品中間濃度所致吸光度的總和； T1為標準品低濃度所致吸光度的總和； I為高、低濃度劑量之比的對數(shù)值，1:08時，I=0.0969。 15.3.2 可靠性測驗 計算方法及要求同管碟法二劑量（2.2）和三劑量（3.3）法。即（2.2）法，回歸、劑間P<0.01，偏

52、離平行P>0.05。（3.3）法，除符合（2.2）法的要求外，二次曲線、反向二次曲線P>0.05。 15.3.3 可信限率 其可信限率除另有規(guī)定外，應不大于5%。 上述各項規(guī)定都能符合者，試驗結(jié)果成立。 15.4 實驗計算所得效價低于估計效價的90%或高于估計銷假的110%，則檢驗結(jié)果僅作為初試，應調(diào)整供試品估計效價，予以重試。 15.5 原料藥效價測定一般需做雙份樣品平行試驗，以使核對。對于檢驗結(jié)果不符合規(guī)定的樣品，應有可靠性測驗及可信限率均符合規(guī)定，且測定結(jié)果在估計效價（原料藥）或標示量（制劑）±10%范圍內(nèi)的至少2個效價測定結(jié)果，必要時應請其他檢驗人員復核，才能發(fā)出檢驗報告。 15.6 效價測定結(jié)果的有效數(shù)字按藥典規(guī)定及數(shù)字修約的原則取舍。