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1、山羊膝關節(jié)僵直動物模型的建立 作者：黃哲元，袁志，衛(wèi)磊，穆尚強，劉建敏，李鵬斌，闞成雙，李巖，張偉，于忠英 【摘要】 目的 建立與人膝關節(jié)僵直相似的動物模型。方法 通過用克氏針在山羊的膝關節(jié)股骨軟骨面造成損傷，在股骨干骺端前側(cè)骨面造成粗糙面以及重疊縫合髕韌帶。然后交叉克氏針聯(lián)合管型石膏伸直位固定膝關節(jié)。術(shù)后8周解除制動。分別測量術(shù)后8周和術(shù)后12周時膝關節(jié)的活動范圍。結(jié)果 無論是在術(shù)后8周還是在解除制動的術(shù)后12周，手術(shù)膝均較對側(cè)出現(xiàn)明顯的伸直性膝關節(jié)僵硬。并且術(shù)后12周和術(shù)后8周比較，山羊手術(shù)膝的僵直程度沒有出現(xiàn)明顯的丟失。結(jié)論 合并軟骨破壞、髕韌帶重疊縫合和伸直位制動可導致山羊

2、膝關節(jié)嚴重和持久的伸直位僵硬。 【關鍵詞】 膝關節(jié);模型;山羊 　　Abstract： Objective To build up animal models with stiff knee which is similar to human knee.Methods Femoral cartilage surface of goat knee was damaged by using Kirschner wire,and the anterior bone surface of femoral metaphysis was made rough and the patellar

3、 ligament was overlapped and sutured.Then the knee joint was fixed in continuous extension with Kirschner wire and plaster cast.The fixation was removed at 8 weeks postoperatively.The range of motion of knee joint was measured at 8 weeks postoperatively and at 12 weeks postoperatively respectively.R

4、esults The extent of knee stiffness was more severe on the operated knee than that on the contralateral knee either at the postoperative 8 weeks or postoperative 12 weeks.There was no obvious difference in the knee stiffness between postoperative weeks 8 and 12.Conclusion Damaging cartilage,overlapp

5、ing and suturing patellar ligament and fixing at extended knee can make knee stiffness serious in goat. 　　Key words:knee joint;models;goat 　　膝關節(jié)僵直常見于膝關節(jié)及其周圍組織結(jié)構(gòu)損傷或手術(shù)后長時間制動的病例[1]。臨床上通常采取功能鍛煉、理療和手術(shù)松解等治療，但仍有相當多的患者治療效果并不理想。長期以來，對膝關節(jié)僵直的治療一直是骨科領域未能很好解決的一個世界性難題。而建立膝關節(jié)僵直動物模型是探索其有效治療新方法、解決該難題的重要一環(huán)。檢索相關

6、資料，卻未發(fā)現(xiàn)理想的膝關節(jié)僵直動物模型，因此本研究擬使用雄性山羊建立膝關節(jié)僵直實驗動物模型，為下一步探索其相關有效治療方法提供模型基礎。 材料與方法 　　1 實驗分組 　　成年雄性山羊3只(第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)，年齡18～24個月，體重 (30±5) kg。每只山羊?qū)⒆笙ピO為實驗組，行手術(shù)固定8周;以右膝為對照組，未予手術(shù)固定。 　　2 模型制備 　　速眠新Ⅱ號注射液 (長春軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所 ) 0.2ml/kg肌肉注射麻醉，麻醉后取仰臥位并置于無菌臺。在左膝關節(jié)前側(cè)做2～3cm的橫行皮膚切口，切斷髕韌帶，翻轉(zhuǎn)髕骨。用骨膜剝離器向近側(cè)剝離上

7、關節(jié)囊，顯露股骨遠側(cè)干骺端前側(cè)，用骨挫將干骺端前側(cè)骨面及大腿前側(cè)肌群深面挫成粗糙面;屈曲膝關節(jié)以暴露上下關節(jié)面，用直徑2mm的克氏針在上下關節(jié)面對稱各鉆4個骨洞直達干骺端松質(zhì)骨內(nèi)，將髕韌帶重疊縫合;用2mm直徑的克氏針交叉固定膝關節(jié)于伸直位，術(shù)畢管型長腿石膏加固膝關節(jié)于伸直位。術(shù)前及術(shù)后肌肉注射青霉素20萬U各1次。術(shù)后回放飼養(yǎng)圈中繼續(xù)喂養(yǎng)。 　　3 膝關節(jié)活動度檢測 　　3.1 術(shù)后8周(去除固定即刻)，活體膝關節(jié)活動度測量：術(shù)后8周，麻醉下拆除左膝長腿管型石膏，拔除克氏針。用長臂量角器，測量雙膝關節(jié)被動活動度范圍;另將肢端平伸后懸掛2.0kg秤砣，測量雙膝關節(jié)相同垂直負荷下的屈

8、曲角度。 　　3.2 術(shù)后12周(去除固定4周)，活體膝關節(jié)活動度測量：去除固定后，將山羊置于飼養(yǎng)圈中自由活動4周?；顒?周(術(shù)后12周)后，麻醉下用長臂量角器，測量雙膝關節(jié)被動活動度范圍;另將肢端平伸后懸掛2.0kg秤砣，測量雙膝關節(jié)相同垂直負荷下的屈曲角度(見圖1)。 　　圖1 去除固定4周將山羊手術(shù)膝肢端懸掛2.0kg秤砣后，仍保持僵直狀態(tài)3.3 術(shù)后12周(去除固定4周)，離體標本膝關節(jié)最大屈曲角度：活體測量后立即將羊處死，切取雙膝關節(jié)標本(留取關節(jié)遠近側(cè)骨段約7.0cm)，用MTS880型材料測試機(MTS公司,美國)對比檢測雙膝標本在50Ncm屈曲的力矩下的屈曲角度。具

9、體方法：將山羊處死，于脛骨和股骨在距關節(jié)線7cm處截斷，切取雙側(cè)膝關節(jié);去除皮膚，保留所有肌肉、肌腱和關節(jié)囊。將測試機兩個夾具分別插入標本的股骨和脛骨的髓腔，并用牙托粉固定;將夾具與材料測試機上下兩端連接。以5mm/min的加載速率給膝關節(jié)施加大小為50Ncm屈曲的力矩，記錄雙膝關節(jié)的最大屈曲角度(見圖2)。實驗過程中始終用生理鹽水保持標本的濕潤。 　　4 取手術(shù)膝與非手術(shù)膝關節(jié)前側(cè)關節(jié)囊5mm×5mm×5mm，常規(guī)甲醛固定，石蠟包埋，切片，進行免疫組織化學染色(見圖3a、b)。光學顯微鏡下400×觀察肌成纖維細胞的數(shù)量及其占全部細胞細胞數(shù)量的百分比。將手術(shù)膝與非手術(shù)膝進行比較，統(tǒng)計學方

10、法采用配對t檢驗。 　　結(jié) 果 　　制動后山羊平均體重較前減少5%。解除制動后，山羊體重逐漸恢復。3只山羊手術(shù)膝與非手術(shù)膝術(shù)后8周及術(shù)后12周分別測關節(jié)活動度(見表1、2)。其中術(shù)后12周離體手術(shù)膝與非手術(shù)膝的最大屈曲角度通過MTS880型材料測試機測得(見表3)。光鏡觀察結(jié)果顯示手術(shù)膝前側(cè)關節(jié)囊肌成纖維細胞的總數(shù)及其占全部細胞細胞數(shù)量的百分比明顯多于非手術(shù)膝前側(cè)關節(jié)囊(P<0.05)。表1 術(shù)后8周時活體膝關節(jié)活動度測量 　　討 論 　　1 造模的目的 　　膝關節(jié)是人體最大最復雜的滑膜關節(jié)，由股骨下端、脛骨上端和髕骨組成，骨與骨之間借關節(jié)囊、關節(jié)內(nèi)外韌帶和

11、內(nèi)外側(cè)半月板相連，它有傳遞負荷、保存運動量和提供包括小腿在內(nèi)的活動動力匹配的功能。外傷和手術(shù)是造成關節(jié)僵直的重要原因，由于下肢骨折長期制動、膝關節(jié)及關節(jié)周圍創(chuàng)傷或炎癥引起關節(jié)的滑動裝置纖維化、攣縮、黏連而導致其僵直、功能障礙。表現(xiàn)為膝關節(jié)屈曲受限甚至伸直位僵直，股四頭肌攣縮、彈性及活動度減小，髕骨活動度減小或消失。臨床常用的治療方法包括推拿按摩、手法松解、藥物、小針刀松解、股四頭肌成形術(shù)、關節(jié)鏡下黏連松解術(shù)等。但以上方法治療效果均不甚理想[2-4]。其中部分手術(shù)治療可能取得較好的短期療效，然而術(shù)中獲得的活動范圍往往在術(shù)后難以長期保持。因此，需要進一步探索一種能更簡便有效治療膝關節(jié)僵直的新方法。

12、 　　根據(jù)膝關節(jié)僵直的臨床特點，我們設計制造了一種外固定架漸進牽拉裝置。該裝置利用杠桿、纜線與滑輪作用原理，通過外固定架及纜線對小腿遠端進行緩慢逐步緊縮牽拉，使小腿以膝關節(jié)為軸隨時間漸進屈曲，達到膝關節(jié)屈曲活動范圍逐步增大的目的。其作用原理是在持續(xù)應力作用下，引導組織發(fā)生生物再塑形。在投入臨床實驗之前，需要建立一種能適用的動物實驗模型，以驗證該器械的有效性。我們查閱了以往文獻報道的多種模擬人類關節(jié)僵硬的動物模型，物種包括兔、鼠、猴子和狗等[5,6]。但這些動物模型均為膝關節(jié)屈曲攣縮性僵硬，尚沒有膝關節(jié)僵直的動物模型。因此，我們選擇具有體型較大、實驗配合度高、抗病力強等優(yōu)點的本地雄性山羊制

13、造膝關節(jié)僵直模型?！　? 造模的方法和依據(jù) 　　導致關節(jié)僵直公認的損傷機制包括：(1)關節(jié)內(nèi)骨破壞、關節(jié)積血;(2)伸膝裝置(股中間肌)與股骨遠端前側(cè)骨面疤瘢黏連;(3) 韌帶損傷：(4)關節(jié)長期伸直位制動。臨床上關節(jié)僵直患者后期關節(jié)僵直的嚴重程度和初始關節(jié)周圍軟組織損傷程度呈正相關。因此我們嘗試通過以下程序制造出具有持續(xù)性僵直的膝關節(jié)動物模型。這一程序包括：(1)控制性關節(jié)內(nèi)骨破壞、關節(jié)積血(克氏針于關節(jié)面鉆孔);(2)用骨銼將伸膝裝置(特別是股中間肌)與股骨遠端前側(cè)骨面造成損傷;(3)髕韌帶重疊縫合;(4)交叉克氏針聯(lián)合管型石膏伸直位固定關節(jié)8周。 　　關節(jié)內(nèi)控制性骨破壞及關節(jié)

14、積血既是關節(jié)僵直的主要原因，同時也是制造關節(jié)僵直動物模型的關鍵。過去傳統(tǒng)的造模方法是在動物膝關節(jié)股骨髁的兩側(cè)去除部分骨皮質(zhì)形成骨窗[7]。Fukui等[7]認為這種方法既可以產(chǎn)生關節(jié)內(nèi)控制性骨破壞，還可以產(chǎn)生關節(jié)內(nèi)出血。在本實驗中，我們沒有采取以上在股骨髁部位開骨窗的方式制造骨折，而是直接用交叉克氏針在膝關節(jié)表面非負重面鉆孔。這種方法同樣可以達到制造穩(wěn)定性關節(jié)內(nèi)骨折并造成關節(jié)內(nèi)出血的目的，同時也簡化了操作的步驟。 　　由于創(chuàng)傷或手術(shù)導致的韌帶損傷以及伸膝裝置(股中間肌)與股骨遠端前側(cè)骨面瘢痕黏連被認為是導致人類多數(shù)急性關節(jié)損傷后關節(jié)僵直的原因之一。因此我們在造模過程中增加了對伸膝裝置(股

15、中間肌)與股骨遠端前側(cè)骨面的破壞。我們的結(jié)果顯示以上措施有助于膝關節(jié)僵直動物模型的建立。 　　多數(shù)損傷后出于緩解疼痛和減少炎癥反應的需要常常對關節(jié)進行制動。但是延長制動對關節(jié)活動不利，大量的實驗研究和臨床證實，長期制動可產(chǎn)生結(jié)締組織攣縮外，還包括肌肉的萎縮、僵硬和變?nèi)?，以及骨關節(jié)炎的形成，制動是其中主要的原因之一。有證據(jù)表明對關節(jié)內(nèi)骨折進行外固定處理的時間都>8周。有實驗證明，5～10周的制動，關節(jié)僵硬的嚴重程度沒有明顯的差異[7]。因此我們選擇8周作為制動時間。目前已經(jīng)有多種制動方式應用于關節(jié)僵硬的實驗動物模型，包括石膏、外固定、克氏針內(nèi)固定或鋼板、螺釘?shù)萚8-11]。我們選擇制

16、動方式以簡單有效為標準。以克氏針交叉固定為基礎，考慮到動物的實驗依從性較差，為確保關節(jié)制動的確實有效，我們另外加上了關節(jié)外管型石膏加強固定。8周后一并拆除石膏和克氏針解除固定。 　　既往的膝關節(jié)僵硬動物模型多數(shù)在解除制動后，關節(jié)活動度會逐漸恢復，原有的僵硬角度會出現(xiàn)全部或部分丟失[12-14]。因此我們在解除山羊膝關節(jié)制動后繼續(xù)觀察了4周并測量重新手術(shù)膝與非手術(shù)膝的僵直角度。我們發(fā)現(xiàn)手術(shù)膝關節(jié)并沒有出現(xiàn)明顯的僵直角度丟失。由此我們認為，本實驗中的山羊動物模型具有和人類僵直膝關節(jié)相似的持久性。 　　3 造模的效果 　　為檢驗動物模型膝關節(jié)僵直的程度是否符合本實驗的初始要求，我們

17、采用多種測量方式進行測量比較，分別在術(shù)后8周測量活體以及術(shù)后12周分別測量活體和離體的雙膝關節(jié)僵直程度。實驗結(jié)果表明，無論是在術(shù)后8周還是在解除制動的術(shù)后12周，手術(shù)膝均較對側(cè)出現(xiàn)明顯的伸直性膝關節(jié)僵硬。并且術(shù)后12周和術(shù)后8周比較，山羊手術(shù)膝的僵直程度沒有出現(xiàn)明顯的丟失。因此我們認為上述膝關節(jié)僵直動物模型可以實現(xiàn)了實驗的目的，并且該模型具有和人類僵直膝關節(jié)相似的持久性。在實驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)術(shù)后12周時山羊活體和離體膝關節(jié)僵直程度存在差別，這種差別可能是由于離體測量標本去除了表面皮膚以及人為測量誤差所致。 　　總之，我們研究的結(jié)果顯示當合并骨、膝韌帶破壞和伸直位制動可導致山羊膝關節(jié)嚴重

18、和持久的伸直位僵硬。這種山羊膝關節(jié)僵直模型具有造模簡便、僵直角度不易丟失以及適應性廣等特點。因此，該動物模型的建立為未來的藥物和矯形支具干預提供了更有潛力的實驗對象。 【參考文獻】 　[1]Morrey BF,Askew LJ,Chao EY.A biomechanical study of normal functional elbow motion[J].J Bone Joint Surg(Am),1981,63(6): 872-877. 　　[2]Morrey BF.The posttraumatic stiff elbow[J].Clin Orthop Relat Re

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