《實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)免費(fèi)版》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)免費(fèi)版（8頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。

1、第一部分 臨床實(shí)驗(yàn) 1. 研究對(duì)象與分組 納入標(biāo)準(zhǔn)：（l）PCOS組符合2003年P(guān)COS鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者；對(duì)照組通過(guò) 輸卵管造影或腹腔鏡檢查提示有輸卵管梗阻或嚴(yán)重粘連的單純輸卵管因素性不 孕患者。⑵年齡選擇：女方年齡20-39周歲。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其它內(nèi)分泌疾病女性；②合并有輸卵管積水、子宮內(nèi)膜病 變、子宮畸形等其它影響妊娠結(jié)局因素的女性；③家族遺傳病史；④供卵周期 2. 研究方法：回顧隊(duì)列，多元回歸分析 3. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 3.1 多囊卵巢綜合征行輔助生殖助孕后對(duì)妊娠結(jié)局的影響 3.1.1研究人群描述：本研究共納入年齡在 20-39 歲，輸卵管因素不孕患者707 例，PCO

2、S患者115例?；€資料女方年齡、男方年齡、促排方案、獲卵數(shù)、 胚胎移植來(lái)源具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不孕年限、受精方式、胚胎移植數(shù)、胎產(chǎn)數(shù)無(wú) 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。妊娠結(jié)局中期流產(chǎn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，生化妊娠率、臨床妊娠率、異 位妊娠率、早期流產(chǎn)率、早產(chǎn)率、死產(chǎn)率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 PCOS 患者臨床妊娠 率73.91%高于對(duì)照組64.78%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但具有臨床意義。 表 研究人群描述 不孕因素 輸卵管因素 多囊卵巢綜合征因 P-value P-value* (n=707) 素(n=115) 女方年齡（歲） 30.5983 ± 3.9872 28.4870 ± 3.4192 <0.00

3、1 <0.001 男方年齡（歲） 32.3013 ± 4.9503 30.0789 ± 4.0092 <0.001 <0.001 不孕年限（年） 3.9161 ± 2.9785 4.2297 ± 2.5926 0.295 0.036 促排方案 <0.001 - 短效長(zhǎng)方案 401 (57.7810%) 50 (44.2478%) 長(zhǎng)效長(zhǎng)方案 52 ( 7.4928%) 28 (24.7788%) 拮抗劑方案 241 (34.7262%) 35 (30.9735%) 獲卵數(shù) 11.2837 ± 5.3816 14

4、.8393 ± 5.6210 <0.001 <0.001 受精方式 0.224 - IVF 613 (86.7044%) 94 (82.4561%) ICSI 94 (13.2956%) 20 (17.5439%) 移植胚胎來(lái)源 <0.001 - 新鮮周期 439 (62.0934%) 29 (25.2174%) 冷凍周期 268 (37.9066%) 86 (74.7826%) 移植胚胎數(shù) 0.664 - 1 108 (15.3627%) 19 (16.9643%) 2 5

5、95 (84.6373%) 93 (83.0357%) 分娩方式 0.138 - 順產(chǎn) 97 (25.0646%) 12 (16.9014%) 剖宮產(chǎn) 290 (74.9354%) 59 (83.0986%) 胎產(chǎn)數(shù) 0.323 - 單胎 281 (39.7454%) 49 (42.6087%) 雙胎 107 (15.1344%) 22 (19.1304%) 生化妊娠率 35 ( 4.9505%) 6 ( 5.2174%) 0.903 0.82 異位妊娠率 12 ( 1.6973%)

6、 1 ( 0.8696%) 0.509 1 臨床妊娠率 458 (64.7808%) 85 (73.9130%) 0.055 - 早期流產(chǎn)率 41 ( 5.7992%) 8 ( 6.9565%) 0.627 0.67 中期流產(chǎn)率 15 ( 2.1216%) 4 ( 4.1083%) 0.043 0.049 早產(chǎn)率 69 ( 9.7595%) 18 (15.6522%) 0.057 - 活產(chǎn)率 388 (54.8798%) 71 (61.7391%) 0.17 - 死產(chǎn)率 2 ( 0.2829%) 1 ( 0.8696%) 0.33

7、3 0.364 P值*:如是連續(xù)變量，用Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)得出，如計(jì)數(shù)變量有理論數(shù) <10,用Fisher精確概率檢驗(yàn)得出 3.1.2多元回歸分層分析：在調(diào)整了混雜因素后，將新鮮周期與冷凍周期進(jìn)行分 層比較，觀察指標(biāo)除臨床妊娠率和早產(chǎn)率在冷凍周期中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，余均 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但上述指標(biāo)臨床意義較大，冷凍周期中，多囊卵巢綜合征患者 較輸卵管因素患者不良妊娠結(jié)局增加，生化妊娠率增加 7%，異位妊娠率增加 26%，早期流產(chǎn)率增加 15%，臨床妊娠率增加 101%，而活產(chǎn)率增加只增加 24%，多難卵巢因素的患者容易發(fā)生流產(chǎn)和早產(chǎn)。 表二 多元回歸分層分析 妊娠

8、結(jié)局 新鮮周期(n=468 56.93%) OR (95%CI) Pvalue Non-adjusted Adjust 生化妊娠率 0.94 (0.12, 7.38) 0.9564 0.74 (0.0 & 6.89) 0.7909 異位妊娠率 0.00 (0.00, Inf) 0.9938 0.00 (0.00, Inf) 0.9960 臨床妊娠率 0.61 (0.29, 1.29) 0.1964 0.56 (0.24, 1.30) 0.1759 早期流產(chǎn)率 0.57 (0.07, 4.33) 0.5846 0.82 (0.10, 6.68) 0.8508 中期

9、流產(chǎn)率 0.00 (0.00, Inf) 0.9938 0.00 (0.00, Inf) 0.9958 早產(chǎn)率 0.00 (0.00, Inf) 0.9832 0.00 (0.00, Inf) 0.9837 活產(chǎn)率 0.80 (0.37, 1.69) 0.5511 0.72 (0.31, 1.67) 0.4480 死產(chǎn)率 0.00 (0.00, Inf) 0.9965 0.00 (0.00, Inf) 0.9992 冷凍周期(n=354 43.07%) OR (95%CI) Pvalue 妊娠結(jié)局 Non-adjusted Adjust 生化妊娠率 0.8

10、1 (0.29, 2.24) 0.6827 1.07 (0.35, 3.30) 0.9105 異位妊娠率 0.78 (0.09, 7.04) 0.8221 1.26 (0.11, 14.27) 0.8502 臨床妊娠率 2.21 (1.21, 4.03) 0.0094 2.01 (1.15, 3.24) 0.011 早期流產(chǎn)率 1.49 (0.59, 3.80) 0.3981 1.15 (0.40, 3.33) 0.7930 中期流產(chǎn)率 1.82 (0.52, 6.37) 0.3495 2.16 (0.52, 8.98) 0.2906 早產(chǎn)率 2.96 (1.50

11、, 5.83) 0.0017 2.82 (1.31, 6.08) 0.0082 活產(chǎn)率 1.52 (0.92, 2.53) 0.1046 1.24 (0.71, 2.18) 0.4544 死產(chǎn)率 3.14 (0.19, 50.76) 0.4201 2.07 (0.11, 40.74) 0.6309 調(diào)整變量：女方年齡; 男方年齡; 促排方案; 移植胚胎數(shù); 受精方式; 取卵總數(shù) 3.2 多囊卵巢綜合征行輔助生殖助孕后對(duì)新生兒出生體重的影響 3.2.1 研究人群描述：本研究共納入單胎足月分娩的上述病例，輸卵管因素不孕 患者281例，PCOS患者49例。基線資料女方年齡、男

12、方年齡、獲卵數(shù)、胚胎 移植來(lái)源具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，孕周、分娩方式、新生兒性別、新生兒出生體重?zé)o 統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 表三 研究人群描述 基線指標(biāo)描述 輸卵管因素 (n=281) 多囊卵巢綜合征因 素(n=49) P-value P-value* 女方年齡 30.20 ± 3.67 28.45 ± 3.19 0.002 0.001 男方年齡 32.06 ± 4.59 29.63 ± 3.42 <0.001 <0.001 不孕年限 3.81 ± 2.61 4.38 ± 2.37 0.165 0.046 取卵總數(shù) 12.24 ± 5.63 14.85 ± 4.9

13、2 0.003 <0.001 孕周 38.60 ± 1.63 38.27 ± 2.76 0.244 0.994 移植胚胎來(lái)源 <0.001 - 新鮮周期 169 (60.14%) 10 (20.41%) 冷凍周期 112 (39.86%) 39 (79.59%) 移植胚胎數(shù) 0.216 0.245 1 53 (18.86%) 13 (26.53%) 2 228 (81.14%) 36 (73.47%) 分娩方式 0.285 - 順產(chǎn) 90 (32.14%) 12 (24.49%

14、) 剖宮產(chǎn) 190 (67.86%) 37 (75.51%) 新生兒性別 0.155 - 男 157 (55.87%) 22 (44.90%) 女 124 (44.13%) 27 (55.10%) 新生兒體重 3318.42 ± 509.41 3238.57 ± 569.20 0.321 0.465 3.2.2多元回歸分層分析：在調(diào)整了混雜因素后，將新鮮周期與冷凍周期進(jìn)行分 層比較，新鮮周期，多囊卵巢綜合癥患者較輸卵管因素患者體重減輕 128.80g， 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，冷凍周期，多囊卵巢綜合癥患者較輸卵管因素

15、患者體重減 輕16.66g,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 表四 多元回歸分層分析 Exposure 新鮮周期(n=179 54.24%)卩(95%CI) Pvalue 冷凍周期(n=151 46.75%)卩(95%CI) Pvalue Non—adjusted 20.95 (-263.48, 305.39) 0.8854 -139.99 (-356.57, 76.60) 0.2072 Adjust -128.80 (-388.85, 131.25) -16.66 (-228.70, 195.38) 0.3332 0.8779 調(diào)整因素: 女方年齡; 取卵總數(shù); 移植胚胎數(shù)

16、; 不孕年限; 男方年齡;受精方式; 孕周; 分娩方式; 促排方案。 第二部分 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 1.建立小鼠模型： 本實(shí)驗(yàn)選擇6-8周齡ICR小鼠1:1雌雄合籠，孕6.5天開(kāi)始，每天給予頸部皮下 脫氫表雄酮DHEA (60mg/kg?d)油劑注射構(gòu)建實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為單純玉米油 注射。劑量選擇根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道。18.5天頸部處死小鼠后，收集胎鼠及子鼠胎盤(pán) 標(biāo)本，稱重并記錄。 2結(jié)果 2.1兩組胎鼠存活率比較 實(shí)驗(yàn)組孕母7只與對(duì)照組孕母6只差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組胚胎總著床、存活數(shù)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組平均窩仔數(shù)、存活率 低于對(duì)照組(P<0.05),見(jiàn)表2

17、。 表2兩組胚鼠存活率比較(x土 s ) Table 2 Comparison of survival rates of the two groups of embryonic rats （ x 土 s ） 分組 孕母鼠數(shù)/ 只 胚胎總著床 數(shù) 存活數(shù) 平均窩仔數(shù)/ 只 存活率 實(shí)驗(yàn)組 ( DHEA) 7 110 85 12.14±1.95 77.27% 對(duì)照組(玉米 油) 6 108 99 16.5±1.64 91.67% X2t 0.958 1.215 0.682 6.431 5.781 P 0.449 0.691 0.

18、795 0.000 0.000 2.2 兩組胎鼠體重、胎盤(pán)重量及胎盤(pán)效率比較 DHEA 組與 NC 組胎盤(pán)效率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)；實(shí)驗(yàn)組胎鼠重量、胎盤(pán)重量均低于NC組(P<0.05),見(jiàn)表3。 表3兩組胎鼠體重、胎盤(pán)重量及胎盤(pán)效率比較(x土s ) Table 3 Comparison of fetal rat weight, placental weight, and placental efficiency between the two groups 分組 鼠數(shù)/只 胎鼠重量( mg) 胎盤(pán)重量 ( mg) 胎盤(pán)效率 (F/P) 對(duì)照組(玉米

19、油) 99 1477.75±176.47 102.93±17.82 14.34±1.98 實(shí)驗(yàn)組 ( DHEA) 85 1324.31±183.67 93.55±16.08 14.65±2.36 X2/t P 6.392 5.602 1.213 0.000 0.000 0.693 2.3兩組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平比較 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)兩組胎盤(pán)的葡萄 糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組Slc2al、Slc2a2、Slc2a3、Slc2a9、Slc2al2表達(dá)水平下調(diào) (P<0.05),見(jiàn)圖 1。 -aAa- u.2cncnaldxa

20、善皂罡 圖1兩組胎盤(pán)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體mRNA表達(dá)水平比較 Figure 1 Comparison of the expression of glucose transporter mRNA in the placenta between the two groups 2.4 兩組氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水平比較 兩組胎盤(pán)的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體 mRNA 表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組 Slc38a1、Slc38a2、Slc38a4、Slc43a2、Slc7a5、Slc7a8 表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖 2。 _ 1.5 -q I I對(duì)旦晝組 S T ■實(shí)驗(yàn)組 圖 2 兩組氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)水

21、平比較 Figure 2 Comparison of amino acid transporter expression levels between the two groups 兩組小鼠D18.5天胎鼠早產(chǎn)率分析 分組 孕母鼠數(shù)/只 早產(chǎn)母鼠 早產(chǎn)率 對(duì)照組 （玉米油） 10 2 20% 實(shí)驗(yàn)組（DHEA） 12 5 41% P值 <0.01 1.資料與方法 1.1動(dòng)物資料 選擇2018年1月-2018年3月購(gòu)置的6-8周齡ICR雌鼠和雄鼠，雌鼠體質(zhì)量 （30-40） g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK （陜）2017-003，所選動(dòng)物均購(gòu)置于*

22、********，自由飲 水、進(jìn)食，自然光照，飼養(yǎng)溫度20-23 口，飼養(yǎng)環(huán)境濕度40-60%。 1.2主要藥品與試劑 脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone DHEA）購(gòu)自美國(guó)ApexBio公司； RNA 的抽提采用 TRIzol? Reagent 購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光聚合酶 鏈反應(yīng)試劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司；PCR引物由中國(guó)上海生物工程有限公司合成。 1.3主要儀器與設(shè)備PCR儀、CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD；全波長(zhǎng) 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)MD SpectraMax公司；ND2000分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo

23、公司；4□高 速離心機(jī)（北京中原聚經(jīng)貿(mào)有限公司）、超低溫冰箱（BECKMAN公司）、水平電泳儀（北京 中原聚經(jīng)貿(mào)有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（上海生物工程有限公司）。 1.4 方法 （1）干預(yù)方法。對(duì)照組：為單純玉米油注射。從孕6.5 天開(kāi)始每天經(jīng)頸部皮下注 射單純玉米油0.2m 1；實(shí)驗(yàn)組：DHEA油劑注射。給予頸部皮下脫氫表雄酮DHEA油劑 （60mg/kg?d）,連續(xù)均完成12.5d干預(yù)，第18.5d干預(yù)完畢后以斷頸方式處死，收集胎鼠及 子鼠胎盤(pán)標(biāo)本。（2）目的基因mRNA表達(dá)測(cè)定。1、RNA的分離、提?。簩⑻ケP(pán)轉(zhuǎn)入2ml玻 璃組織的勻漿器中，加入2ml Trizol孕漿，室溫放置5mi

24、n，使其充分裂解，勻漿液分別移 入2個(gè)1.5m1EP管中。4口，12000rpm,離心5min，棄沉淀，留上清。加入200u1氯仿，震 蕩混勻后室溫放置15min。4口，12000rpm離心，15min；吸取上層水相，至另一離心管中； 加入等體積的異丙醇（至少50u1）,混勻，室溫放置5-10min。4口，12000rpm,離心lOmin, 棄去上清，RNA沉淀于管底；加入lOOul 75%乙醇，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀；4口 8000g 離心5min，盡量棄去上清；室溫晾干5min（目測(cè)晾干）其中一管用75%乙醇保存，另一管 用50u1-30u1水溶解RNA樣品。2、逆轉(zhuǎn)錄：嚴(yán)格按照逆轉(zhuǎn)錄試

25、劑盒說(shuō)明書(shū)體系要求以及反 應(yīng)條件要求，每組標(biāo)本取1 yL RNA樣本加至20 yL體系中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，25口 lOmin, 42口 15min，85口 5s，4□結(jié)束獲得cDNA。3、目的基因mRNA表達(dá)水平測(cè)定，實(shí)時(shí)熒光定 量 PCR 技術(shù)，引物根據(jù) PrimerBank 上所查的序列，由上海生工生物工程有限公司合成， 引物序列如下（表1）。建立反應(yīng)體系如下：熒光染料SYBR Green Master Mix（2x）10u1，滅 菌蒸餾水6yL, PCR正向引物取1yL、反向引物取1yL, cDNA模板2yL，總體積為20yL。 每例樣本均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。PCR反應(yīng)條件如下：95

26、 °C預(yù)變性5 min, 95°C變 性15 s, 58C退火30s, 72C延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，隨后95C延伸15s, 95C60s, 95C 15s。反應(yīng)結(jié)束后記錄擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以確定樣本擴(kuò)增的特異性。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲 線，得到每個(gè)樣本的循環(huán)閾值（ct值），采用2-DDct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。 表1 目的基因引物序列 Tab1e 1 Primer sequence of target genes 目的基因 正向引物序列（5' - 3'） 反向引物序列（5' — 3'） Target gene Forward primer sequence Revers

27、e primer sequence Slc2al GCTTATGGGCTTCTCCAAACT GGTGACACCTCTCCCACATAC Slc2a2 TCAGAAGACAAGATCACCGGA GCTGGTGTGACTGTAAGTGGG Slc2a3 GATCGGCTCTTTCCAGTTTG CAATCATGCCACCAACAGAG Slc2a5 CCAATATGGGTACAACGTAGCTG GCGTCAAGGTGAAGGACTCAATA Slc2a6 AACCGAGGGACTCGACTATGA CAAGGCATACCCAAAGCTGAA Slc2a8 C

28、CCTTCGTGACTGGCTTTG TGGGTAGGCGATTTCCGAGAT Slc2a10 GCCTGACCTTCGGATATGAGC TGCCATAGCAGTCAATGAGGA Slc2a12 AGGTCCCAGCATGTTTACGTT GGGCTAATAGCGTTCTGATCTG Slc7a5 ATATCACGCTGCTCAACGGTG CTCCAGCATGTAGGCGTAGTC Slc7a8 TGTGACTGAGGAACTTGTGGA GTGGACAGGGCAACAGAAATG Slc38a1 CCTTCACAAGTACCAGAGCAC GGCCAG

29、CTCAAATAACGATGAT Slc38a2 TAATCTGAGCAATGCGATTGTGG AGATGGACGGAGTATAGCGAAAA Slc38a3 GGAGGGGCTTCTACCAGTG GGAAAAGGATGATGCCCGTATTG Slc38a4 GCGGGGACAGTATTCAGGAC GGAACTTCTGACTTTCGGCAT Slc43a1 CTTCCGGGCTTCACCTATCTG CCCAATTCCAAATCGCATCCAC Slc43a2 TGCACCGCTGTGTTGGAAA CCGTGCTGTTAGTGACATTCTC Gapdh TGACATCAAGAAGGTGGTGAAG AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAG