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1、網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)展及其臨床應(yīng)用,概述,網(wǎng)織紅細(xì)胞(reticulocyte，Ret)是介于晚幼紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞之間的過渡階段細(xì)胞，略大于成熟紅細(xì)胞。網(wǎng)織紅細(xì)胞是有核紅細(xì)胞剛剛失去核的階段，仍屬未完全成熟的紅細(xì)胞，漿內(nèi)尚殘留有嗜堿性RNA，經(jīng)堿性染料（如天青B、煌焦油藍(lán)或新亞甲藍(lán)）活體染色后，在包體內(nèi)可見藍(lán)色點(diǎn)狀或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，故名網(wǎng)織紅細(xì)胞。,概述,紅細(xì)胞在骨髓中生成，至發(fā)育為成熟紅細(xì)胞，經(jīng)歷了不同階段：干細(xì)胞、原始紅細(xì)胞、早幼紅細(xì)胞、中幼紅細(xì)胞、晚幼紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞，最后發(fā)育為成熟紅細(xì)胞。隨著細(xì)胞的成熟，RNA含量逐漸減低，至細(xì)胞完全成熟后消失或接近消失，即紅細(xì)胞中網(wǎng)線狀結(jié)構(gòu)越多，表示細(xì)胞越

2、幼稚。ICSH將Ret分為4型：型（絲球型）、型（花冠型或網(wǎng)型）、型（破網(wǎng)型）、型（顆粒型）。正常生理狀態(tài)下，型只存在于骨髓，型在外周血也很難見到，型僅有少量釋放到外周血，因此外周血網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)以型為主。,概述,Ret是紅細(xì)胞成熟過程中的一個(gè)重要階段，是判斷骨髓紅系造血情況和療效觀察的重要指標(biāo)。其檢測(cè)方法既有傳統(tǒng)的顯微鏡目測(cè)法，又有現(xiàn)代化的儀器計(jì)數(shù)法(如流式細(xì)胞儀、網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)儀及血細(xì)胞分析儀)?，F(xiàn)對(duì)Ret的檢測(cè)進(jìn)展，各檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)及其在臨床上的應(yīng)用逐一講述。,網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)進(jìn)展,1.手工法 2.血細(xì)胞分析儀法 3.流式細(xì)胞儀法和專用網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀,1.手工法,手工法分玻片法和試管

3、法。由于玻片法容易使混合血液中的水分蒸發(fā)，染色時(shí)間偏短，因此結(jié)果偏低；試管法容易掌握，重復(fù)性較好，必要時(shí)還可以從混合血液中再取標(biāo)本重新涂片復(fù)查。試管法被列為手工法Ret計(jì)數(shù)的參考方法。按衛(wèi)生部全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程第2版，采用試管法用煌焦油藍(lán)染液對(duì)血液標(biāo)本進(jìn)行紅細(xì)胞活體染色、制片，選擇細(xì)胞分布較均勻、厚薄適中的體尾交界處，每份標(biāo)本油鏡下參照陳寶梁的建議 ，即Ret6 %，計(jì)數(shù)紅細(xì)胞1000個(gè)；3% 5 %計(jì)數(shù)紅細(xì)胞2000個(gè)；1 %2% 應(yīng)計(jì)數(shù)紅細(xì)胞4000個(gè)；小于1 %計(jì)數(shù)紅細(xì)胞10000個(gè)。,1.手工法,傳統(tǒng)的顯微鏡計(jì)數(shù)方法操作較繁瑣、影響結(jié)果的因素較多。近年來，國(guó)內(nèi)開始使用國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化

4、委員會(huì)(ICSH)推薦的Miller窺盤進(jìn)行計(jì)數(shù)，規(guī)范了計(jì)算區(qū)域，減少了實(shí)驗(yàn)誤差，使結(jié)果準(zhǔn)確性有所提高(衛(wèi)生部臨檢中心建議，CV控制在15 %之內(nèi))。Miller窺盤法是將一種光學(xué)圓片狀Miller窺盤安放在顯微鏡目鏡中，窺盤中有面積比例為1：9的2個(gè)正方形計(jì)數(shù)方格，只需計(jì)數(shù)19小方格內(nèi)的紅細(xì)胞即可準(zhǔn)確估量出整個(gè)大方格內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)量。,衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心控制Ret計(jì)數(shù)CV15%需鏡檢的RBC數(shù)目,1.手工法,國(guó)內(nèi)很多學(xué)者在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了幾種改良的Ret計(jì)數(shù)窺盤。張時(shí)民等設(shè)計(jì)了一種雙環(huán)式結(jié)構(gòu)的Ret計(jì)數(shù)窺盤，該盤的特點(diǎn)是小圓環(huán)和大圓環(huán)面積之比為1：10，小圓環(huán)為計(jì)數(shù)紅細(xì)胞數(shù)量，大圓環(huán)為計(jì)數(shù)Ret

5、數(shù)量。其圓形結(jié)構(gòu)更加適合于人們觀察和計(jì)數(shù)顯微鏡下細(xì)胞數(shù)量的習(xí)慣，而且此比例更加易于計(jì)算紅細(xì)胞和Ret的比值。,1.手工法,陳高遠(yuǎn)則在這兩種窺盤的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了改良式Miller窺盤，采用雙正方形結(jié)構(gòu)，小方格和大方格之比也達(dá)到1：10，只是將紅細(xì)胞計(jì)數(shù)區(qū)域位移至中心部位，以方便紅細(xì)胞數(shù)量的計(jì)數(shù)。,1.手工法,劉志賢設(shè)計(jì)了一種新的Ret計(jì)數(shù)窺盤即1804扇形Ret計(jì)數(shù)窺盤：圓形直徑為19 mm，圓心角 AOB=COD=EOF= GOH=180?；B=CD=EF=GH=180。計(jì)算公式為：Ret %=整個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)的Ret數(shù)(4個(gè)小扇面區(qū)域內(nèi)的RBC總數(shù)5)100 。這種新型Ret計(jì)數(shù)窺盤4個(gè)扇形區(qū)

6、域均勻分布在整個(gè)視野的4個(gè)方向，4個(gè)扇形面積之和是整個(gè)圓形面積的15，因此在理論上基本解決了紅細(xì)胞分布不均勻引起的問題，降低了系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差 。,手工法網(wǎng)織紅細(xì)胞活體染色染料評(píng)價(jià),2.血細(xì)胞分析儀法,1993年以來，可進(jìn)行Ret計(jì)數(shù)的血細(xì)胞分析儀相繼問世，因其具有重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、省時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，正被越來越多的醫(yī)院所采用。儀器法Ret計(jì)數(shù)使用各種熒光染料和非熒光染料對(duì)Ret進(jìn)行染色，采用鞘流技術(shù)和射頻技術(shù)等不同原理進(jìn)行檢測(cè)。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀不僅可以計(jì)數(shù)Ret，同時(shí)還能檢測(cè)出網(wǎng)織紅細(xì)胞絕對(duì)值Ret#、網(wǎng)織紅細(xì)胞平均體積(MRV)、網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)(RMI)等許多參數(shù)，這些參數(shù)是Ret分析、臨床應(yīng)

7、用和研究的熱門領(lǐng)域。,2.血細(xì)胞分析儀法,統(tǒng)計(jì)表明，儀器法測(cè)定Ret精密度有明顯提高：對(duì)低Ret標(biāo)本，CV值在10%21 %之間；對(duì)正常范圍的標(biāo)本，C V值在3 %16 %之間；高值標(biāo)本，C V值在2 %10 %之間。,2.血細(xì)胞分析儀法,雖然儀器法Ret計(jì)數(shù)有諸多優(yōu)點(diǎn)，而且精密度明顯優(yōu)于手工法，但也存在一些不足 ：第一，所有儀器分析的基本原理都是檢測(cè)Ret內(nèi)RNA 的存在量來決定其百分率和絕對(duì)值，當(dāng)某些患者血液中有核細(xì)胞或淋巴細(xì)胞異常增加時(shí)，可導(dǎo)致Ret計(jì)數(shù)結(jié)果的假性增加；第二，冷凝集素存在、紅細(xì)胞的聚集、某些病理因素或藥物都能使紅細(xì)胞產(chǎn)生自身熒光；第三，自動(dòng)化分析儀結(jié)果的準(zhǔn)確性除了依賴于儀

8、器本身的良好性能外，還應(yīng)有良好的質(zhì)控物隨時(shí)檢測(cè)儀器的狀態(tài)。另外，儀器成本高、價(jià)格貴，基層醫(yī)療單位投入較為困難。,3.流式細(xì)胞儀法和專用網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀,流式細(xì)胞儀(flowcytometry，F(xiàn)CM)是一種多用途的精密分析儀器，應(yīng)用派若寧、吖啶橙、噻唑橙等這些特殊的熒光染料與Ret中的RNA結(jié)合，當(dāng)FCM 發(fā)出的激光照射于細(xì)胞上時(shí)，根據(jù)細(xì)胞能否發(fā)射出特定顏色的熒光，通過單參數(shù)定量測(cè)定RNA，從而精確測(cè)定Ret占成熟紅細(xì)胞的比率。還可根據(jù)激光照射后發(fā)射出的熒光強(qiáng)度，或光吸收量大小、光散射量多少等參數(shù)的比例關(guān)系對(duì)Ret成熟程度進(jìn)行分群，將其劃分為低熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞(LFR)、中熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞

9、(MFR)、高熒光強(qiáng)度網(wǎng)織紅細(xì)胞(HFR)。,3.流式細(xì)胞儀法和專用網(wǎng)織紅細(xì)胞分析儀,FCM 測(cè)定精密度明顯高于手工法36倍，可在數(shù)秒中檢測(cè)20000個(gè)以上的紅細(xì)胞，如Ret在1.76.6 %，其平均CV值在4.3 %。不足之處，流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)Ret受HOWELLJolly小體、瘧原蟲和血小板等干擾。,網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法學(xué)評(píng)價(jià),網(wǎng)織紅細(xì)胞檢測(cè)的臨床應(yīng)用,Ret計(jì)數(shù)及其各種參數(shù)(IRF、RMI、MRV、RPI等)在貧血的診治、骨髓移植、腫瘤的放化療和藥物療效檢測(cè)等方面具有重要參考價(jià)值。,1網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的應(yīng)用,貧血的恢復(fù)是通過骨髓釋放紅細(xì)胞生成素(EPO)完成的，Ret增加可被看成是骨髓造血功能

10、對(duì)貧血的正常反應(yīng)。失血性貧血時(shí)患者Ret各項(xiàng)指標(biāo)會(huì)顯著增高，失血510 d內(nèi)Ret可達(dá)高峰，出血停止后2周可恢復(fù)正常，臨床上可應(yīng)用此參數(shù)和特點(diǎn)來判別出血是否停止；缺鐵性貧血、巨幼細(xì)胞性貧血時(shí)也可見患者Ret輕度增加。Ret降低主要和造血功能減低有關(guān)，典型病例為原發(fā)性再生障礙性貧血、溶血性再生障礙性危象；此外還有急性白血病、繼發(fā)性再生障礙性貧血、化療和放療引起的骨髓造血功能抑制或減退等。,2網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用,RPI代表網(wǎng)織紅細(xì)胞的生成相當(dāng)于正常人的多少倍。不同生理、病理情況下，Ret從骨髓釋放人外周血所需時(shí)間不同，故Ret計(jì)數(shù)值不能確切反映骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)造血功能，還應(yīng)考慮Ret

11、生存期限。通常Ret生存期限約為2d，若未成熟網(wǎng)織紅細(xì)胞提前釋放入血，Ret生存期限將延長(zhǎng)，為了糾正網(wǎng)織紅細(xì)胞提前釋放引起的偏差，用RPI來反映Ret生成速率。,2網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用,RPI= RET% 被測(cè)HCT/ 正常人HCT 1/ RET 成熟天數(shù)。釋放入外周血的網(wǎng)織紅細(xì)胞越趨于幼稚，其成熟時(shí)間越長(zhǎng)。由于網(wǎng)織紅細(xì)胞體積大于成熟紅細(xì)胞，大量網(wǎng)織紅細(xì)胞的提前釋放在某種程度上影響血細(xì)胞比容的測(cè)定結(jié)果。經(jīng)觀察，網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟時(shí)間與Hct存在下列關(guān)系,2網(wǎng)織紅細(xì)胞生成指數(shù)(RPI)的應(yīng)用,RPI在估計(jì)紅細(xì)胞生成有效性和貧血起因的分類方法中起到重要作用。Kinetic等應(yīng)用RPI較為

12、準(zhǔn)確地表達(dá)出Ret的成熟狀態(tài)，從而對(duì)貧血的類型進(jìn)行劃分，如健康者平均RPI為1，當(dāng)RPI3時(shí)表示紅細(xì)胞生成增加，如溶血性貧血和治療后的營(yíng)養(yǎng)性貧血；而RPI2時(shí)為紅細(xì)胞生成減少，如缺鐵性貧血；對(duì)于EPO缺乏、無效造血等情況時(shí)，RPI多在23之間，Kinetic法則還無法確定。,3網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟度(IRF)的應(yīng)用,IRF為不成熟的Ret與總Ret的比值，健康者平均值為0.22，參考范圍0.10.38，IRF越大表示不成熟的Ret的數(shù)量越多。這種幼稚Ret水平的改變一般比患者HGB、血小板、白細(xì)胞和臨床癥狀的變化出現(xiàn)更早。IRF和HFR的增高在很多白血病患者化療中是與粒細(xì)胞反應(yīng)一致的指標(biāo)和骨髓移植后

13、恢復(fù)的第一信號(hào) 。IRF與Ret#和RPI呈一弱的、顯著的正相關(guān)：IRF增加(0.23)，一般伴有Ret#增加，提示患者對(duì)于貧血有足夠的紅系反應(yīng)；若IRF0.23，且RPI2，則說明紅系造血活性下降，則以慢性腎功能不全居多；Ret#正?；蚵缘?，RPI2，但I(xiàn)RF0.23，見于急性感染、鐮狀細(xì)胞性貧血危象、妊娠和MDS等狀況。IRF是評(píng)價(jià)貧血紅系增生活性的一項(xiàng)新的有用的指標(biāo)，IRF結(jié)合Ret#和RPI可以為進(jìn)一步闡明貧血分類提供有價(jià)值的信息。,4網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)(RMI)的應(yīng)用,該參數(shù)是計(jì)算參數(shù)，可由儀器自動(dòng)計(jì)算，也可將儀器測(cè)定的Ret分群參數(shù)經(jīng)過人工計(jì)算得到。計(jì)算公式為：RMI=(MFR+H

14、FR)LFR100 %。文獻(xiàn)報(bào)道RMI的參考范圍，男性：17 % 37 %，女性：1 6 %35 %。據(jù)報(bào)道，急性白血病化療后Ret#正常而RMI較高，化療中則Ret#和RMI都低；出現(xiàn)溶血危象時(shí)Ret#和RMI都高；ITP則Ret#正常而RMI較高。,5網(wǎng)織紅細(xì)胞分群的應(yīng)用,LFR 和HFR可作為貧血鑒別診斷的初篩指標(biāo)。 研究表明，溶血性貧血(HA)患者由于骨髓造血功能活躍，大量新生的Ret釋放到外周血，導(dǎo)致Ret、LFR和HFR明顯增高；。腎性貧血時(shí)HFR上升，LFR下降而Ret變化不大；缺鐵性貧血患者鐵劑治療前，Ret無明顯改變，HFR輕度增高，鐵劑治療一周后，Ret及HFR可呈中度增高

15、，因此兩個(gè)參數(shù)可作為缺鐵性貧血患者鐵劑治療后的療效觀察指標(biāo)；再生障礙性貧血(AA)患者外周血Ret中度減低，而HFR中度增高，這種現(xiàn)象可能反映了AA患者造血功能紊亂時(shí)的紅細(xì)胞生成變化；在鑒別診斷MDS方面，MDS患者產(chǎn)生的大量生存期延長(zhǎng)的“幼稚”的Ret是導(dǎo)致HFR增加的原因。,5網(wǎng)織紅細(xì)胞分群的應(yīng)用,HFR和MFR+HFR可作為骨髓移植、化療的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，尤其是MFR+HFR的變化可以作為評(píng)價(jià)腫瘤患者化療期間檢測(cè)骨髓造血功能受抑制和開始恢復(fù)的較敏感指標(biāo)。文獻(xiàn)報(bào)道 ，骨髓移植后血小板、中性粒細(xì)胞、白細(xì)胞、Ret及目測(cè)法Ret計(jì)數(shù)恢復(fù)的天數(shù)分別為16.4、16.8、16.2、13.7、14.8 d。,